科研 | 内蒙古农业大学：辅助益生菌通过调节肠道微生物组和血清代谢组减轻哮喘症状（国人佳作）

导读

哮喘是世界上发病率和死亡率较高的一种常见慢性炎症性呼吸系统疾病，它的病因和发病机制尚不清楚，但已知该病与多种因素有关。微生物失调会加剧肺部炎症和哮喘相关症状。益生菌已显示出抗炎作用，并可调节肠-肺轴。最近的研究表明，共生微生物群的改变或局部失调不仅会直接影响定植部位，还会影响远端器官和系统。动物实验表明，通过补充益生菌靶向调控肠道微生物群，对哮喘有预防和治疗作用。但是益生菌在控制哮喘中的应用尚未在人体临床试验中取得一致的结果。 本试验旨在研究益生菌在控制哮喘方面的辅助功效，采取随机、双盲、安慰剂对照方法，安慰剂组（N=26），益生菌组（Probio-M8）（N=29），对第1个月和第3个月采集两组粪便样品进行宏基因组组装，发现益生菌辅助治疗后肠道微生物恢复力更高，益生菌组患者粪便中Bifidobacterium animalis、Bifidobacterium longum和Roseburia hominis等丰度显著增加；而Clostridiales bacterium的丰度显著降低。持续治疗3个月后益生菌组哮喘控制评分比安慰剂组显著提高。与0天相比，益生菌组显著降低肺泡中一氧化氮浓度（P < 0.05）。益生菌干预3个月后血清代谢组学显著改变（P< 0.043），血液中十二烷酸、肠二醇、色氨酸和鞘磷脂等代谢物水平与安慰剂组相比均显著提高。干预期间受试者肠道二十二碳四烯酸、内油酰乙醇酰胺、赤酮酸、鞘磷脂和胆固醇脂等含量显著高于安慰剂组（P < 0.05）。结果表明，Probio-M8与常规疗法协同作用，通过肠-肺轴调节肠道菌群，促进血液中关键生物活性化合物的合成和分泌，提高宿主免疫进而改善哮喘患者的临床疗效。

实验设计

本试验采取随机、双盲、安慰剂对照方法，招募了58名年龄在18-75岁的哮喘受试者参与为期6个月的临床试验，其中益生菌组29人（11名男性，18名女性），而安慰剂组为26人（12名男性，14名女性）。益生菌组志愿者每日使用信必可和服用乳双歧杆菌Probio-M8（2 g; 3×1010 CFU/天），安慰剂组每日使用信必可和服用等量的安慰剂。分别在初始点，第1个月和第3个月采集两组志愿者的粪便样本，共计93份，使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit对93份粪便样本进行DNA提取，用琼脂糖凝胶电泳和纳米分光光度计检测DNA质量，Illumina HiSeq 2500对得到的DNA进行宏基因组测序经质控后生成630.62 Gbp的高质量reads。Binning后得到高质量基因组2601个，去冗余后选出代表性种水平基因组（SGBs）389个。

试验设计及受试者排除和纳入流程

结果

1益生菌辅助治疗可改善哮喘的治疗效果 试验期间通过调查临床指标发现，干预期间，与安慰剂相比益生菌组肺泡中一氧化氮浓度（CaNo；P = 0.038）和呼出一氧化氮浓度（FeNO；P = 0.049）显著降低，哮喘控制（ACT）评分显著提高（P < 0.006；图1a），且持续治疗3个月后改善效果更加显著（P <0.022）。与0天相比，益生菌组在干预1个月后CaNo、FeNo显著降低，ACT评分显著提高（P < 0.05）。此外，益生菌组与安慰剂组在肺功能指标(PEF、PEV1、PVC)和嗜酸性粒细胞百分数等指标均未观察到辅助疗效，两组间各时间点血清IgE水平无显著差异，但安慰剂组的IgE水平在干预期间/后显著升高。表明Probio-M8作为哮喘治疗辅助剂可以显著改善临床治疗效果。

图1 哮喘患者临床指标及宏基因组分析流程。（a）治疗对哮喘控制分数、肺泡一氧化氮浓度、嗜酸性细胞百分数、总淋巴细胞数、部分呼出一氧化氮浓度和免疫球蛋白E数量的影响。（b）宏基因组组装、分箱、比对和聚类流程，生成2601个高质量的SGBs。Pro和Pla代表益生菌组和安慰剂组。

2 哮喘患者肠道微生物的基因组特征

宏基因组测序样本binning后得到了2601、430和508个高质量、中质量和低质量的MAG（宏基因组组装基因组），原始序列和样本间的平均映射比率为77.21% ± 3.73%，表明大部分基因组属于已知的微生物群落。经drep去冗余后得到代表性的种水平基因组（SGBs）389个（图1b），其中包括10个门、19个纲、24个目、39个科、78个属和247个种。为研究未被发现的SGBs，将389个SGBs与IGG和MAGs数据库进行比对后，发现有62个SGBs未被注释到种水平，属于厚壁菌门（90.32%）。将SGBs与IGG和Cell_MAGs数据集进行交叉比较，发现27个SGB与任何当前已知的物种均不匹配（平均核苷酸相似性<95%），从而证明了它们的新颖性。

通过将宏基因组的序列映射到Probio-M8参考基因组，发现益生菌组的Probio-M8菌株的丰度逐渐增加，而在安慰剂组中则没有，表明摄入的Probio-M8菌株能够通过受试者消化道。

3 益生菌辅助治疗可调节肠道微生物组成 通过对哮喘患者肠道微生物多样性研究发现，安慰剂组的alpha多样性显著降低（P < 0.05），而益生菌组保持稳定（图2a），表明摄入益生菌可能有助于维持肠道菌群多样性。此外，在不同时间点两组间beta多样性无显著差异（图2b）。 通过比较益生菌组和安慰剂组在试验前后菌群丰度变化，鉴定出4个SGBs在0天时无显著差异，仅在益生菌组发生显著变化，例如Bifidobacterium animalis和Roseburia hominis的丰度显著增加，而 Parabacteroides distasonis 的丰度在服用 Probio-M8 后显著降低；在安慰剂组中，鉴定出16个SGBs在0天时发生显著变化，例如梭菌科、厚壁菌门和一些不可培养的SGBs。其中 Blautia 和 Ruminococcus sp. AF37-6AT的丰度显著降低，Coprococcus eutactus和Eubacterium sp. CAG:274的丰度显著增加（P< 0.05）。检测到3个SGBs在基线时没有显著差异，但在治疗结束时在益生菌组和安慰剂组间有显著差异。与安慰剂相比，益生菌组中Bifidobacterium longum和Prevotella sp. CAG的丰度显著上升，而 Clostridiales bacterium 的丰度显著降低（P< 0.05）（图2c）。

图2 哮喘患者肠道细菌群落的结构、多样性和SGBs特征。（a）益生菌组和安慰剂组在不同时间点的Shannon多样性指数。（b）不同时间点益生菌组和安慰剂组主坐标（PCoA）分析。（c）不同时间点益生菌组和安慰剂组间SGBs的显著差异。经FDR法校正P值，P < 0.05即差异显著。Pro和Pla分别代表Probio-M8组和安慰剂组。 4益生菌辅助治疗可调节肠道微生物代谢模块和生物活性化合物 为了观察389个SGBs代谢变化的潜在模块（GMM），基于MetaCyc和KEGG数据库，构建了与哮喘相关的肠道特定代谢模块，包括短链脂肪酸（SCFAs）、组胺、多不饱和脂肪酸、胆汁酸、色氨酸、鞘脂和维生素D等代谢模块（图3a）。所鉴定的GMMs属于10个不同的门，主要为厚壁菌门（72.75%）、拟杆菌门（13.11%）和放线菌门（4.11%）。益生菌受试者肠道中更高含量的微生物群（SGBs）参与丁酸合成和色氨酸代谢，而安慰剂组更高含量的微生物群（SGBs）参与乙酸降解。

通过MelonnPan进一步预测肠道微生物群代谢图谱，共鉴定出80个代谢产物。Procrustes分析表明在治疗过程中，微生物和预测代谢产物间具有正相关（R=0.351；P = 0.001）（图3b）。同时发现，益生菌干预期间受试者肠道二十二碳四烯酸、内油酰乙醇酰胺、赤酮酸、鞘磷脂和胆固醇脂等含量显著高于安慰剂组（P < 0.05）（图3c）。这些活性代谢物均与调节炎症、免疫功能有关。提示Probio-M8在调节特定生物活性代谢产物和相关通路方面具有辅助效果。

图3 益生菌和安慰剂组在两个时间点的肠道代谢模块和预测代谢产物的差异。（a）肠道代谢模块（GMMs）由益生菌组和安慰剂组之间的特定显著差异SGBs编码。圆圈代表SGBs编码的相应代谢模块。柱状图表示益生菌和安慰剂组不同时间编码模块中SGBs的含量。（b）对两组患者在不同时间点的预测微生物组和代谢组进行Procrustes分析，显示微生物组和代谢组之间存在正相关关系（correlation=0.351; P =0.001）。（c）预测不同的生物活性代谢产物对益生菌处理的反应。采用FDR法对P值进行校正，P <0.05为显著性阈值。Pro和Pla分别代表益生菌组和安慰剂组。

5益生菌辅助治疗可调节血清代谢产物 为进一步探究人类肠道微生物组与宿主代谢之间的相互作用，分析了治疗过程中血清代谢产物的变化。PCoA分析显示，在治疗1个月时，摄入Probio-M8轻微改变了血清代谢组学（P < 0.06），在治疗3个月时显著改变了血清代谢组学（P < 0.043），而安慰剂组在治疗期间没有发生显著改变（图4a）。 为进一步筛选差异丰富代谢产物，通过PLA-DA模型分析发现0天时在益生菌和安慰剂组差异不显著，而试验期间差异显著的代谢物有30种（图4b）。采用血液数据库对其注释后，发现有16种代谢物可注释到对应化合物。在益生菌干预后，血液中十二烷酸、肠二醇、色氨酸和鞘磷脂等代谢物水平与安慰剂组相比均显著增强（图4c）。这些代谢物能够抑制信号通路发挥抗炎作用并参与免疫反应。以上结果表明，益生菌作为宿主和肠道微生物的调节因子，在联合信必可治疗哮喘的过程中能特异性调节部分血清代谢物从而提高临床疗效。

图4 LC-MS评价哮喘患者血清代谢产物特征。（a）益生菌组和安慰剂组中的 主坐标（PCoA） 分析。安慰剂和益生菌组在不同时间点的样本符号用不同颜色显示。（b）检测到的代谢产物在基线时没有显著性差异，但在第1个月和第3个月时两组之间有显著性差异。（c）益生菌治疗后血清代谢产物的变化。采用FDR法对P值进行校正，P < 0.05为显著性阈值。Pro和Pla分别代表益生菌组和安慰剂组。

6 益生菌辅助治疗可调节肠道噬菌体 为研究肠道噬菌体是否发生变化，使用VIBRANT和DeepVirFinder等预测工具识别噬菌体序列。预测到13078个非冗余病毒OTUs (vOTU)，这些vOTUs的平均基因组大小为28.50 ± 56.17 Kbp，大部分为片段化基因组。其中12.73%的噬菌体可以归为特定的家族，突出了当前噬菌体的新颖性（图5a）。安慰剂组肠道噬菌体组多样性显著降低(P < 0.05)，而益生菌组在治疗过程中没有显著变化（图5b），表明益生菌与信比可联合用药有助于维持肠道噬菌体的多样性。PCoA分析发现，在不同时间点，安慰剂组和益生菌组的整体肠道噬菌体分布没有显著差异。(P > 0.05, ANOSIM)（图5c）。 在受试者肠道菌群中鉴定到10个噬菌体科，其中最占优势的病毒科是Iridoviridae和Podoviridae。与基线相比，益生菌组Myoviridae的平均丰度在第1个月时显著降低，而Herelleviridae的平均丰度在第3个月时显著升高（图5d）。当噬菌体与细菌组的多样性相关时（R=0.895; P < 0.001，图5e），在益生菌组（R=0.916; P < 0.001）和安慰剂组（R=0.873; P < 0.001）也有显著的相关性。此外，研究发现在受试者中，细菌组与噬菌体组之间存在较强的协同关系（correlation = 0.782; P = 0.001）（图5f），强调肠道病毒组感染细菌的专一性。

图5 哮喘患者肠道噬菌体群落结构，多样性及噬菌体特征。（a）31441个DNA病毒操作分类单元（OTU）的质量分类和科水平注释信息。（b）益生菌组和安慰剂组在两个不同时间点的shannon指数多样性。（c）益生菌组和安慰剂组在三个时间点的主坐标（PCoA）分析。（d）益生菌组和安慰剂组在科水平上注释的噬菌体的相对丰度。（e）时间相关分析显示哮喘患者肠道菌群与噬菌体Shannon多样性指数之间均存在较强的正相关（R=0.895; P < 0.001）。（f）对两组患者不同时间点的肠道细菌和噬菌体进行Procrustes分析，显示细菌组与病毒组呈正相关（correlation=0.782; P = 0.001）。Pro和Pla分别代表益生菌组和安慰剂组。

7 粪便中的细菌组和病毒组与血清代谢组、肠道微生物代谢潜能和表型有关 基于Permanova评估细菌组与生物活性化合物、临床指标、血清代谢物和噬菌体之间的总体影响程度，272个SGBs（P < 0.05）解释了这些指标的显著差异。其他组学的大部分差异来自细菌（平均值：55.34%，范围：28.8% - 78.31%）。与安慰剂组相比，菌群在益生菌组解释的生物活性化合物、临床指标和血清代谢产物的方差分别为9.80%、3.60%和1.30%（图6a）。此外，在益生菌组和安慰剂组中，影响多组数据集排名前20的细菌包含Bifidobacterium longum、Firmicutes bacterium AM10-47、Ruminococcu ssp. AF37-6AT和Firmicutes bacterium CAG:83等益生菌富集的SGBs。综上所述，与传统治疗相比，益生菌联合信比可治疗对肠道病毒群的影响较小，而对临床指标、血清代谢组和肠道微生物代谢潜力的影响较大。

图6 益生菌驱动途径调节肠-肺-轴。（a）益生菌组和安慰剂组肠道菌群对肠道微生物活性化合物、血清代谢产物、临床指标和噬菌体组成的影响大小。（b）肠-肺-轴和宿主反应的关键益生菌驱动通路示意图。Pro和Pla代表益生菌组和安慰剂组。

讨论

本研究探讨了一种新型益生菌Probio-M8对哮喘症状的辅助治疗。结果显示，相比于安慰剂组，益生菌干预1个月后ACT评分明显改善，且持续治疗3个月后改善效果更加显著（P < 0.01）。此外，1个月时，益生菌组和安慰剂组呼出一氧化氮浓度均显著降低（P < 0.05）。与基线期相比，益生菌组在治疗期间显著降低了肺泡一氧化氮浓度（P < 0.05）。在试验期间，安慰剂组血清IgE水平持续显著升高，益生菌组无显著升高，而IgE水平的升高可能会加剧支气管哮喘患者的症状。表明与常规治疗相比，益生菌辅助治疗提高了哮喘的临床疗效，减轻了小气道炎症。

研究发现，常规治疗显著降低了安慰剂组患者肠道细菌和病毒的alpha多样性（P < 0.05），但在益生菌组未发生改变。Dickson等人发现，药物治疗导致的细菌多样性减少通常与哮喘症状相关。儿童过敏性哮喘的发展与先前较低的肠道微生物多样性有关。本研究发现，药物的吸入可能会降低肠道菌群的多样性，而联合使用Probio-M8可以增加肠道菌群的顺应性，保持患者的肠道微生物多样性。此外，PCoA的结果表明，缓解症状的作用并非由于肠道细菌和噬菌体群落结构的剧烈变化。益生菌干预后某些SGBs显著增加（如B. animalis，B. longum，Prevotella sp. CAG，R. hominis，Ruminococcus callidus），而其他一些SGBs显著下降（如Clostridiales bacterium，Parabacteroides distasonis）。其他研究也发现特定的肠道细菌与哮喘密切相关，哮喘患者的肠道中Clostridium和Eggerthellalenta的含量高于健康人。一项关于儿童哮喘患者的研究发现患者粪便中Streptococcus和Bacteroides的相对丰度增加，而Bifidobacterium和Ruminococcus的相对丰度降低。以上结果表明，维持健康不仅依赖于肠道的多样性，也依赖于特定的肠道功能菌株。

有趣的是，Probio-M8治疗后，改善了抗炎微生物的生物活性、代谢途径和血清代谢组。结果表明，益生菌组患者血液代谢物中的色氨酸含量明显高于安慰剂组，其显著增加了具有生物活性潜能的丁酸合成和色氨酸代谢相关途径SGBs的多样性，提高血清色氨酸水平。色氨酸代谢产物与芳香烃受体相互作用，促进免疫稳态，在体循环中发挥抗炎抗氧化作用。先前的报道称，妊娠和断奶期间小鼠口服SCFAs对子代过敏性肺部炎症有保护作用，特别是丁酸盐能有效诱导子代肺部Treg。人类进行的多项观察性研究发现，婴儿期粪便中短链脂肪酸的减少与后期的哮喘有关。综上所述，SCFAs在哮喘发生发展中的十分重要，可能有助于抑制肺部的促炎反应。其潜在机制可能是某些SCFAs为结肠细胞提供能量来源，而未代谢的SCFAs进入外周循环和身体远端部位（肺部），调节Treg淋巴细胞和各种调节细胞因子的活性。此外，研究结果显示，益生菌治疗后，患者亚油醇乙醇胺、C18:1、胆固醇酯和C18:0鞘磷脂的预测水平显著升高，而血液代谢物中鞘磷脂的水平显著高于安慰剂组。亚油醇乙醇胺是一种生物活性脂肪酸，通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用。鞘磷脂存在于动物细胞膜，先前的研究发现，早期粪便中鞘脂水平低与食物过敏有关，因此鞘脂代谢产物可能对哮喘有保护作用，但是否可能通过其他机制影响哮喘的病理生理仍需进一步研究。

评论

本研究以服用Probio-M8后调节机体肠道菌群和相关代谢为着眼点，对受试者的肠道基因组特征、微生物群组成、肠道噬菌体和相关血清代谢物等进行一系列研究。发现Probio-M8 通过调节肠道菌群和病毒组，提高肠道微生物和血清代谢物的生物活性代谢潜能。同时，Probio-M8促进肠道和血液中一些关键生物活性化合物的分泌和合成，通过体循环系统直接调节肠-肺轴，从而有效缓解小气道炎症，改善哮喘患者的临床症状。综上所述，与常规方案相比，益生菌联合信必可使哮喘患者的临床疗效显著提高。

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