基于网络药理学和分子对接方法研究山花晶颗粒抗视疲劳的作用机制

摘 要：目的 基于网络药理学探讨山花晶颗粒抗视疲劳的作用机制。方法 利用中药系统药理学分析平台（TCMSP ）和中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN ）筛选山花晶颗粒的活性成分和潜在作用靶点，通过STRING 数据库富集信号通路；采用Cytoscape 软件分析蛋白质- 蛋白质相互作用（protein-protein interaction ，PPI ）网络中的关键靶点，采用分子对接实验对主要活性成分和关键靶点的结合能力进行验证。结果 山花晶颗粒筛选出槲皮素、熊果酸、大黄素等66 个主要活性成分以及多巴胺受体D2 （dopamine receptor D2 ，DRD2 ）、5- 羟色胺受体1A （5-hydroxytryptaminereceptor 1A ，HTR1A ）、毒蕈碱型胆碱受体M2 （cholinergic receptor muscarinic2 ，CHRM2 ）等34 个潜在作用靶点，富集分析出神经活性配体- 受体相互作用、钙信号通路、环单磷酸腺苷（cyclic adenosinemonophosphate ，cAMP ）信号通路等35 条相关信号通路，分子对接结果表明主要活性成分与关键作用靶点的对接构象合理。结论 山花晶颗粒能够通过“多成分- 多靶点- 多通路”抑制细胞凋亡和炎性因子的产生，从而减轻眼部细胞氧化和损伤，发挥抗视疲劳的作用。

随着现代生活节奏的加快，以及手机、电脑的普及应用，人们用眼时间不断延长，视疲劳已成为目前眼科常见的临床疾病之一[1]。视疲劳又称眼疲劳，主要以视物模糊、不耐久视、干涩不适、酸胀流泪等为临床表现。中医学将视疲劳称为肝劳，病因为过用目力、情志内伤、外感湿邪、饮食偏嗜，其中以过用目力为最主要因素；病机以虚为主，虚实夹杂；常夹郁夹湿，病位以肝、肾、气为主，证候大致可分为肝肾阴虚、肝肾阴虚夹气滞、肝肾阴虚夹湿3 型，其中以肝肾阴虚最为多见[2]。

菊花和枸杞子作为清肝明目的著名药对，出现在石斛夜光丸、枸菊地黄丸等多个经典方中[3]。菊花具有清热解毒、去肝火的功效[4]；枸杞具有滋补肝肾、养肝明目的功效[5]。现代药理学研究发现，菊花、枸杞子中含有丰富的多糖、黄酮类、叶黄素等多种活性成分，具有清除自由基、改善眼部不适的作用[6-11]。山花晶颗粒是在菊花和枸杞子的基础上增加1 味山楂而成，山楂具有调血脂、抗癌、抗氧化和增强免疫力的药理作用[12]，且山楂与枸杞子配伍可以协同调血脂和抗氧化[13]。山花晶颗粒具有滋补肝肾、清肝明目的功效，临床上主要用于治疗肝肾阴虚引起的眼睛干涩、视力模糊、目赤肿痛等视疲劳症状，亦可用于高血压、高血脂症，但其抗视疲劳的药效成分及关键作用靶点尚不清楚。本研究基于网络药理学对山花晶颗粒中的活性成分及作用机制进行预测，并通过分子对接方法验证活性成分与靶点的结合能力，以期为山花晶颗粒的进一步开发及应用提供依据。

1方法

1.1 山花晶颗粒活性成分收集及靶点筛选

借助中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP ，http://tcmspw.com/tcmsp.php ）[14-15 ]，以“菊花”“枸杞子”“山楂”为关键词，以口服生物利用度≥20% 、类药性≥0.1 为筛选条件[16-17]，并结合文献整理菊花、枸杞子和山楂的活性成分，根据筛选后的化学成分收集对应的药物靶点；借助中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN ，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/ ）[18]，以“菊花”“枸杞子”“山楂”为关键词，收集山花晶颗粒中的活性成分，以Targetscore ≥20 为筛选条件，保留符合条件的活性成分对应的药物靶点[19]。

1.2 “中药-活性成分-药物靶点”网络的构建

通过TCMSP 和BATMAN 在线数据库筛选药物作用靶点，借助UniProt （https://www.uniprot.org/ ）校正靶点对应的基因名，限定物种为人。采用Cytoscape 3.6 软件构建“中药- 活性成分- 药物靶点”网络图，用Network Analyzer 插件分析山花晶颗粒的活性成分和药物靶点。

1.3 抗视疲劳潜在作用靶点的获取

由于收集到的疾病靶点与视疲劳的相关性较差，本研究选择从药物靶点出发，寻找潜在作用靶点。从TCMSP数据库[20]中筛选出菊花、枸杞子、山楂所对应的靶点，整合后删除重复项，得到TCMSP数据库药物总靶点；从BATMAN数据库[21]中筛选出3味药材对应的靶点，整合后删除重复项，得到BATMAN数据库药物总靶点。为避免单个数据库收载药物靶点的偏向性，提高与抗视疲劳功效的相关性，将2个数据库中筛选出的药物总靶点同时在线导入Venn在线软件作图工具平台进行Venn分析，获得的交集靶点即为抗视疲劳潜在作用靶点。

1.4抗视疲劳潜在作用靶点蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建

将抗视疲劳潜在作用靶点在线导入STRING 数据库（https://string-db.org/ ），限定物种为人，得到蛋白与蛋白间的相互作用信息[22-23]，将获得的数据导入Cytoscape 3.6 软件，生成PPI 网络图。通过CytoNCA 插件对网络进行拓扑分析，分析内容包括中心性（degreecentrality ，DC ）、介度中心性（betweenness centrality ，BC ）、特征向量中心性（eigenvector centrality ，EC ）、接近中心性（closenesscentrality ，CC ）。

1.5关键靶点的富集分析

将关键靶点在线导入STRING 网站，得到基因本体（gene ontology ，GO ）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes ，KEGG ）通路富集分析[24-25]。以P ＜0.01 为基本标准，按由小到大的顺序选择前20 条基因注释目录和信号通路目录进行分析，运用R 软件对分析结果进行可视化处理。

1.6 活性成分与靶点的分子对接验证

选择PPI 网络中度值排名靠前的5 个靶点作为关键靶点，将整理的所有活性成分与关键靶点进行对接。从TCMSP 数据库下载活性成分的分子结构，导入Sybyl-X 2.0 软件，运用Minimize 模块进行能量优化，获得稳定的分子构象，mol2 格式输出保存。通过蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/ ）[26]下载靶点的结晶复合物，格式选择pdb ，采用Sybyl-X 2.0 软件的标准对接模块进行分子对接，删除靶点内的水分子，添加非极性氢原子，抽取蛋白原配体，以便生成对接位点空腔进行对接。对接完成后，根据低能量和构象合理的原则选择最佳对接构象。

1.7中药- 归经网络的构建

通过检索《中国药典》2020 年版[27]，获得山花晶颗粒中山楂、菊花、枸杞子3 味中药的归经，构建山花晶颗粒中药- 归经网络。

2结果

2.1山花晶颗粒活性成分收集及靶点筛选

通过数据库检索以及文献查阅[28-31]，共得到66 个活性成分见表1 ，其中山楂有15 个、菊花36 个、枸杞子24 个，有7 个重复活性成分，有2 个活性成分存在于3 味药材中。

2.2 “中药-活性成分-药物靶点”网络的构建

“中药- 活性成分- 药物靶点”网络见图1 ，包含303 个节点和1062 条边。通过Network Analyzer 插件分析网络的拓扑学性质，BC 、CC 和DC 均较大的活性成分为槲皮素、芹菜素、山柰酚、木犀草素、β- 谷甾醇，分别对应147 、63 、60 、50 、43 个靶点，为网络的中心节点，表明这些活性成分与靶点的相互作用在网络中起到了关键作用，不同活性成分作用于多个不同靶点，同一靶点也对应不同活性成分，体现出山花晶颗粒是多成分、多靶点的网络体系。

2.3 作用靶点的Venn分析

将TCMSP 和BATMAN 数据库中共有的药物靶点作为潜在作用靶点，即233 个药物靶点和528 个药物靶点同时在线导入Venn 在线软件作图工具平台进行Venn 分析，获得交集靶点68 个见图2 ，即可能为山花晶颗粒抗视疲劳的潜在作用靶点。

2.4 PPI网络的构建

将68个交集靶点在线导入STRING数据库，得到蛋白间的相互作用信息和KEGG信号通路，在逐个筛查前30条中，找到4条与肝脏、眼睛相关的信号通路。将此4条通路上的靶点进行富集，得到34个靶点，导入STRING数据库得到蛋白间相互作用信息，运用Cytoscape 3.6软件，通过插件cytoNCA对网络进行拓扑分析，计算得到DC、BC、EC、CC的中位数分别为7、21.99442、0.117 226 253、0.488 915 71。根据大于中位数的筛选标准，选出13 个关键节点，对PPI 进行网络清晰化，见图3 。越靠近中心区域的靶点相互作用越强，最内圈的多巴胺D2 受体（dopamine receptor D2 ，DRD2 ）、5- 羟色胺受体1A （5-hydroxytryptamine receptor 1A ，HTR1A ）、胆碱能毒蕈碱受体2 （muscarinicacetylcholine receptors ，CHRM2 ）、一氧化氮合成酶3 （nitric oxide synthase 3 ，NOS3 ）、毒蕈碱型胆碱受体M1 （cholinergicreceptor muscarinic 1 ，CHRM1 ）、μ- 阿片受体（μ-opioid receptor ，OPRM1 ）、肾上腺素能受体α2a （adrenergicreceptor α2a ，ADRA2A ）、谷氨酸受体2 （glutamate receptor 2 ，GRIA2 ）、ADRA2C 、ADRA2B 、γ- 氨基丁酸A 受体α1 （gamma aminobutyric acid A receptorα1 ，GABRA1 ）、肾上腺素能受体β2 （adrenergic receptor β2 ，ADRB2 ）、GABRA2 为山花晶颗粒抗视疲劳的潜在作用靶点。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

将34 个靶点在线导入STRING 网站，得到GO 和KEGG 富集分析数据。GO 功能注释包括细胞组分、分子功能和生物过程3 个方面，分别得到42 、58 、437 个目录，细胞组分主要涉及质膜组成、突触后膜和γ- 氨基丁酸-α 受体复合物；分子功能主要与G 蛋白偶联胺受体活性、神经递质受体活性、跨膜信号受体活性、信号受体活性、肾上腺素能受体活性等相关；山花晶颗粒的生物过程主要涉及腺苷酸环化酶调节G 蛋白偶联受体信号通路、管径调节、血管直径的调节、磷脂酶C 激活G 蛋白偶联受体信号通路、信号转导、G 蛋白偶联受体信号通路、血液循环、系统过程调节、腺苷酸环化酶激活G 蛋白偶联受体信号通路、平滑肌收缩的调节。KEGG 富集分析有60 个目录，以P ＜0.01 为标准进行富集分析，主要涉及到神经活性配体- 受体相互作用、钙信号通路、环单磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate ，cAMP ）信号通路、环磷酸鸟苷（cyclicguanosine monophosphate ，cGMP ）-cGMP 依赖性蛋白激酶（cGMP-dependent proteinkinase ，PKG ）信号通路、胆碱能突触、糖尿病并发症中的年龄- 晚期糖基化终产物受体（receptor of advancedglycosylation end-products ，RAGE ）信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号、逆行内源性大麻素信号、γ- 氨基丁酸能突触、多巴胺能突触、缺氧诱导因子-1 信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调节等信号通路。GO 和KEGG 前20 条目录见图4 、5 。

2.6分子对接验证

以靶蛋白结构内的原配体作为对照，将筛选出的所有活性成分与5 个关键靶点（DRD2 、HTR1A 、CHRM2 、NOS3 、CHRM1 ）对应的活性位点（6CM4 、5V54 、5YC8 、1M9J 、5CXV ）进行分子对接，结果见表2 。小分子与受体结合时的能量越低、构象形状匹配度越高，则对接打分值越高，表明小分子具有的潜在作用活性越强。3 个小分子对比原配体，对接打分值十分接近，表明筛选出的活性成分具有与原配体相当的作用活性。

选取度值排名靠前的活性成分槲皮素、芹菜素和山柰酚进行结果展示见图6 ，槲皮素、芹菜素和山柰酚在DRD2 、HTR1A 、CHRM2 、NOS3 和CHRM1 靶点蛋白活性位点内的对接构象稳定、匹配度良好，均可与靶蛋白形成氢键作用，结合活性良好。

2.7中药- 归经网络的分析

如图7 所示，中药- 归经网络中肝经的连接数为3 ，其余肾经、肺经、胃经、脾经的连接数均为1 ，可见山花晶颗粒的主要作用部位在肝。

3讨论

早在2000 年前，《黄帝内经》就论述了肝与目的关系，其后又得到了历代医家的补充和临床验证。《黄帝内经》曰：“肝气通于目，肝和则目能辨五色矣”；明·缪希雍《本草经疏·卷二》云：“肝虚十证……目光短属肝血虚肾水真阴不足”；清·林之翰《四诊抉微》亦有云：“眼赤多泪积热，头眩不能俯视肝火……羞明怕日，肝肾并见”；由此可见中医讲眼病从肝治的道理所在。通过中药- 归经网络的分析结果可知，山花晶颗粒中3 味药材均入肝经，枸杞、菊花滋补肝肾、清热解毒，山楂健脾消食、酸甘化阴，3 药合用，则可发挥养肝、泻火、明目之功效。与临床上治疗肝肾阴虚引起的眼睛干涩、视力模糊、目赤肿痛等视疲劳症的功效基本吻合。

本研究运用网络药理学的方法对山花晶颗粒所含成分及靶点进行分析，发现3 味药材共含66 个活性成分，作用于233 个药物靶点；其中筛选出34 个关键靶点，具有多成分、多靶点、多途径发挥作用的特点。GO 功能及KEGG 通路富集分析可知，山花晶颗粒可能通过激活钙信号通路和cAMP 信号通路等激活下游磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase ，PI3K ）信号通路，调控凋亡通路，抑制各种凋亡蛋白，减少细胞凋亡，并抑制炎性因子白细胞介素-1β （interleukin-1β ，IL-1β ）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF ）和核因子-κB （nuclear factor-κB ，NF-κB ）等的产生，减轻眼部细胞的氧化和损伤，保护视网膜色素上皮细胞，与目前研究所证实的车前子、青葙子、熟地等归肝经中药发挥明目功效的作用机制基本相符[32-36]。分子对接结果表明，来自于山楂、菊花和枸杞子中度值较高的山柰酚、芹菜素和槲皮素3 种黄酮成分与关键作用靶点蛋白匹配良好，提示该类化合物可能为核心活性成分群。

本研究应用网络药理学和分子对接的方法，对山花晶颗粒的多成分- 多靶点与抗视疲劳靶点之间复杂网络关系进行探究及验证，初步阐释了基于炎性细胞因子信号通路发挥抗视疲劳功效的作用机制，充分体现了中药多组分、多靶点、多层次的整体调节作用，为进一步深入探讨其作用机制奠定了基础，为探索抗视疲劳的药效物质基础和作用机制提供了方向，同时为山花晶颗粒的进一步开发及应用提供了理论基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突