Nature丨肿瘤相关成纤维细胞可诱导抗原特异性CD8+T细胞缺失
导读
许多肿瘤已经形成了干预抗肿瘤免疫应答大多数步骤的机制。很多细胞群有助于抗肿瘤反应，而肿瘤浸润性细胞毒性T细胞发挥主要作用。最新研究表明，肿瘤相关成纤维细胞（CAF）样本，加工和交叉呈递抗原通过PD-L2和FASL，以抗原特异性，抗原依赖性方式杀伤CD8+T细胞，本文主要探讨相关研究成果。
免疫系统是人体主要防御机制，可以清除外源性和内源性威胁，但是许多肿瘤已经形成了干预抗肿瘤免疫应答的几乎每一个必要步骤的机制，如抗原提呈通路变异，抗原呈递细胞失调，物理屏障产生以及抑制性免疫亚群招募（如Treg和髓源性抑制细胞），因此许多抑制机制可以抑制T细胞的功能。很多细胞群有助于抗肿瘤反应，而肿瘤浸润性细胞毒性T细胞发挥主要作用，它们的存在与预后改善相关。
肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境中的抑制性中间体，与患者不良预后相关。CD8+T细胞浸润和细胞毒性是抗肿瘤免疫的最重要决定因素，但是可溶性CAF衍生的信号是否足以或能够驱动T细胞功能状态的改变仍不清楚。由于T细胞通常局限于基质区，研究人员尝试确定CAF介导的CD8+T细胞功能障碍的潜在机制。
主要结果
CAF采样以及蛋白质水解加工外源性抗原
生理性免疫调节部位，如胸腺或淋巴结，需要抗原特异性细胞-细胞间的相互作用来调节T细胞的活性。抗原呈递细胞（APC）通过在MHC-1类分子上交叉呈递外源性样本并捕获抗原实现这一目标，因此，研究人员首先评估了CAF是否具有相似的功能。分离自小鼠肺肿瘤的CAF能够产生物理性尺寸选择性屏障，显著延迟了大MW材料的运输。大MW葡聚糖被CAF吞噬后，研究人员进一步确定，CAF可以清除自体细胞物质和死亡的肿瘤细胞碎片，直接导致离散细胞内区室。为定量检测摄取物的结局，研究人员使用了抗原卵白蛋白（OVA）。FITC-OVA测定表明，所有源自肺腺癌和黑素瘤的成纤维细胞系和肿瘤细胞均不同程度地吞噬抗原，而DQ-OVA荧光证实，淋巴结成纤维细胞（FRC，呈递抗原并调节T细胞）和CAF在蛋白水解加工细胞内OVA方面最有效。这与蛋白酶体无关，而是利用胞内通路。研究人员发现，相较于FRC和正常成纤维细胞，CAF表现出延迟的抗原加工动力学。
CAF交叉呈递外源性抗原
实际上，相较于正常成纤维细胞或FRC，CAF中延迟的内体介导的加工转化为增强的MHC-I和OVA257-264肽复合体交叉呈递。氯喹或氯化铵可阻碍交叉呈递。将OVA表达和GFP标记的肿瘤细胞作为材料来源，我们进一步证实了CAF取样，加工和交叉提呈肿瘤衍生性抗原的能力与可溶性抗原细胞内事件一致。
CAF处理的T细胞细胞毒性功能降低
然后，研究人员确定CAF驱动的抗原交叉呈递是否负调节T细胞，并转化为肿瘤细胞存活优势。研究人员进行了包含CAF，T细胞和肿瘤细胞的培养三重分析（记录肿瘤细胞结局），同时监测T细胞以及CAF功能状态和活性。由于成纤维细胞处理的OT-I T细胞能够有效地杀死靶细胞，因此无论是否预先暴露于OVA，正常成纤维细胞不会保护OVA表达的靶肿瘤细胞。相反，肿瘤细胞培养前，OT-I T细胞经CAF处理时，肿瘤细胞存活显著增强。这种CAF驱动的OT-I T细胞毒性抑制具有抗原特异性和抗原依赖性，因为仅当CAF既往经OVA暴露时才观察到肿瘤细胞活力增强。此外，从受影响的CAF中移除OT-I T细胞时，肿瘤细胞存活增强，这符合CAF-T细胞相互作用驱动不可逆功能修饰，而非依赖长期CAF衍生的可溶性刺激的假设。检测到的保护作用具有抗原依赖性，表达OVA的靶肺癌细胞中也具有类似的保护作用。
CAF通过PD-L2和FASL诱导T细胞死亡
由于抗原负载的CAF条件下，抗原特异性T细胞对靶肿瘤细胞的杀伤功能显著受损，因此研究人员尝试确定CAF介导的T细胞抑制机制。单独培养后的OT-I T细胞活性与正常成纤维细胞或CAF比较结果表明，CAF引起OT-I T细胞活性抗原依赖性降低。T细胞死亡是通过免疫检查点FAS和PD-1表达和参与介导的。暴露于基质细胞后FAS表达增加，而PD-1刺激依赖于抗原。相较于正常成纤维细胞，CAF中更大程度地检测到配体FASL和PD-L2相互表达。然而，PD-L2（而不是PD-L1）是主要的PD-1配体。生理学上，PD-L2具有局限于APC的更受限制的表达方式，但是据研究，PD-L2功能性表达于人结肠癌，肺癌和黑色素瘤的成纤维细胞。此外，流式细胞术分析证实未缺失的T细胞也上调耗竭标记物LAG3，当应用中和抗体特异性阻断CAF上的PD-L2或FASL时，OT-I T细胞维持杀伤其靶标的能力。这些数据意味着，CAF利用肿瘤抗原呈递和关键免疫检查点配体协调上调，驱动抗原特异性T细胞死亡和剩余细胞毒性T细胞区室功能损伤，以保护肿瘤细胞免受免疫破坏。
PD-L2和FASL抑制损害CAF驱动的T细胞抑制
研究人员在免疫活性小鼠肿瘤中也检测到CAF介导的抗原加工和提呈。这与抗原负载的肿瘤中的OT-I T细胞数量减少相对应，并且仅上调肿瘤内抗原特异性T细胞上的FAS和PD-L1表达。全身PD-L2或FASL活性中和表明，肿瘤体积缩小，并且在不存在免疫或基质区室情况下，抗原特异性CD8+T细胞浸润增强。为证实CAF在体内介导这些作用的角色，研究人员通过单独注射肿瘤细胞或联合1:1比例的CAF注射来诱导B16.OVA肿瘤。具体而言，研究人员利用了faslgld突变并且缺乏功能性FASL表达的gld/gld纯合小鼠。gld/gld小鼠肿瘤较小，并且较混合肿瘤（CAF是FASL或WT C57小鼠的唯一来源）含有更多的抗原特异性CD8+T细胞。gld/gld小鼠中的混合肿瘤与野生型C57小鼠中的肿瘤相当，这支持了CAF介导的FASL在体内和体外T细胞缺失中的特定作用。然后，研究人员对比了人类肿瘤组织和正常对组织CAF公共可用微阵列数据集中抑制性配体的RNA表达，结果证实人肺癌中PDCD1LG2基因表达升高。与主要CAF表达免疫抑制配体PD-L2体外和体内研究结果一致，人CAF转录组中无明显CD274变化。此外，肺癌和结肠癌拥有丰富的FASLG，但肿瘤间具有更大程度的变异性。然后，在蛋白质水平上通过免疫荧光证实，肺肿瘤基质区域内PD-L2富集。总之，这反映了小鼠模型中的隔室特异性表达模式，其在功能性阻断时转化为增强的瘤内抗原特异性细胞毒性T细胞功能。
参考文献：
1. Matthew A. Lakins, Ehsan Ghorani, Hafsa Munir, Carla P. Martins & Jacqueline D. Shields.Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8+ T Cells to protect tumour cells.Nature. 2018.
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