龚建平|细胞外囊泡——肝脏疾病诊断中的重要标志物和潜在治疗靶点
细胞外囊泡—肝脏疾病诊断中的重要标志物和潜在治疗靶点
文/龚俊华，游逾，龚建平
龚建平
龚建平，肝胆外科主任，博士后、教授，主任医师，博士研究生和博士后指导教师。国家新世纪“百、千、万”人才工程国家级人选、国务院特殊津贴获得者、国家自然科学基金评审专家、重庆市首席专家工作室（肝胆外科）领衔专家、重庆市“322”人才工程第一层次人选等。主持国家自然科学基金项目10余项和多项省部级科研项目，主持或参加的研究项目先后获得国家科技进步一等奖1项、省部级科技进步奖二等奖3项。近十年来在国内外学术期刊发表论文300余篇，其中被美国科学引文索引（SCI）收录100余篇。
壹
细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)概述
随着对EVs生物学特性的深入理解，描述EVs的术语已经发生了很大变化，过去常互换使用的“微泡”、“外泌体”和“微粒”等术语已被重新定义[1]。现在认为外泌体、微泡和微粒都是属于EVs的亚群，它们共同组成了EVs群体[1]。外泌体是起源于多泡体、直径为50～150 nm的匀质小囊泡[2]；微泡则是由细胞膜直接产生，直径为100～1000 nm[3]；凋亡小体形态类似细胞碎片，直径为500～2000 nm[3]。在这些亚群的相互鉴别方面，一些蛋白质，如脂筏结构蛋白1、热休克蛋白70或主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类和Ⅱ类蛋白质等，曾被视为区分不同EVs亚群的标记物，然而新近研究表明这些标记物并不具有特异性[4]。随着组织化学技术的迅速发展，特定的分子模式未来将有助于对不同类型囊泡的认识和鉴别，但由于提取技术、鉴定方法及命名学的混乱等原因，现在区分这些亚群仍然很困难。因此，在本文中使用统一的术语“EVs”来特指微泡和外泌体[1]。
EVs由囊内容物（蛋白质、脂质和核酸）和其外围包裹的磷脂双分子层组成[1]。在肝脏中，肝细胞分泌的EVs可通过细胞外液而进入血液循环。EVs携带的内容物信息代表了分泌之初其亲代细胞的细胞状态，且这些内容物会随着亲代细胞分泌EVs时的状态和所处环境的改变而发生动态的变化[5]。虽然EVs最初被认为不具备生物学研究价值而并未引起重视，但近年研究表明，EVs是细胞间信息传递的重要纽带，肝脏和其他组织分泌的EVs为临床诊断各种肝脏疾病提供了重要的生物标志物，并可能成为肝脏疾病潜在的治疗靶点。
贰
肝源EVs及其作用靶点
2.1 源于肝脏的EVs
肝细胞既可以分泌EVs，同时也是其自身分泌的或者其他器官产生的EVs的作用靶点[6]。在体外实验中发现，肝脏中的大多数细胞，包括肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)、内皮细胞(sinusoidal endothelial cells，SECs)、库普弗细胞及其他免疫细胞群如巨噬细胞等，都可以分泌EVs[1]。各种肝细胞（包括小鼠和人类原代肝细胞及肝癌细胞系）都能分泌外泌体和微泡。在不同的肝脏疾病中，这些囊泡的数量和内容物均可不同，且都能对细胞间的信息传递进行调控[7]。蛋白质组学分析表明，大鼠肝细胞源EVs中大约251种蛋白产自原代的肝细胞[8]。在对包括EVs中所描述的四旋蛋白及其他类型的细胞表面标记(包括CD63、CD81和CD82)及脱唾液酸糖蛋白受体1跨细胞膜蛋白进行研究后发现，由肝细胞分泌的EVs可引起上述蛋白中肝细胞特异性受体水平增多。肝细胞源EVs携带的内容物涉及多种功能的蛋白质，如细胞色素蛋白、凝血相关蛋白和载脂蛋白类，此外肝细胞分泌的EVs还参与了肝脏解毒过程[1]。在肝硬化中，有研究发现，肝硬化患者与健康个体相比血浆中肝细胞衍生的EVs含有较高的细胞角蛋白18，而且相关白细胞内皮衍生物和肝细胞性EVs的数量与肝硬化程度密切相关[1]。除了肝细胞，SECs也可分泌功能性EVs,被內吞摄取后的SECs源性EVs可触发依赖1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）的HSCs迁移，表明EVs在SECs和HSCs之间起着调节沟通作用[9]。肝脏中丰富的免疫细胞群为EVs提供了另一个重要的来源：体外研究表明，免疫细胞来源的EVs可以介导肝脏中不同类型的免疫细胞和实质细胞之间进行信息传递[10]。
虽然有关外泌体介导肝脏细胞间信息传递已有大量报道，但其所涉及的肝脏生物学进程及其具体机制还未阐明，有待进一步探索。比如在缺血再灌注损伤或部分肝切除小鼠模型中，肝细胞来源的EVs可调节肝脏修复，并通过转移神经鞘氨醇酶和鞘氨基醇激酶2促进肝脏再生，同时增加靶细胞中S1P的产生[11]。另一项研究发现，肝细胞在乙醇暴露后通过外泌体转移miRNA-27a可造成M2表型巨噬细胞活化，实现巨噬细胞与巨噬细胞间的信息传递[5]。以上研究表明，EVs可由肝脏中一种细胞释放而由另一种细胞摄取，由此完成生物信息分子（如miRNAs）介导的细胞间信息传递，最终引起受体细胞的功能变化[1]。此外由于EVs的内容物会随着肝脏细胞所处环境和状态的变化而改变，所以EVs可作为一种生物标记物用于肝脏疾病的检测[1,8]。
2.2 肝脏是EVs的作用靶点
目前主流观点认为，肝脏是机体EVs分布和作用的主要靶点之一，而这与肝脏摄取了大量非肝脏源EVs有一定关系[12]。虽然有研究表明，特定的EVs配体，如跨膜四蛋白或MCHⅠ和MCHⅡ，可以通过不同的信号通路与靶细胞直接进行信息交流而不需要摄取EVs，但大多数EVs功能的发挥还是通过EVs摄取后的信息释放[13]。细胞摄取EVs的方式主要是通过内吞途径，包括网格蛋白依赖和非网格蛋白依赖的內吞[14]。而肝脏正是EVs细胞内吞的高活性区域：IMAI等[15]报道源自小鼠黑色素瘤细胞系B16BL6并标记了PKH26的外泌体能被肝脏和脾脏中的巨噬细胞吞噬摄取，但却不能被肺的巨噬细胞摄取。此外，BALA等[16]对miRNA-155基因敲除的小鼠静脉注射含miRNA-155外泌体丰富的血浆并进行相关检测后发现：肝脏中miRNA-155的表达明显增加，而肾脏却增加不明显，提示肝脏细胞中确实发生了外源性外泌体内信息分子的摄取；在肝脏中miRNA-155表达变化最明显的是肝细胞和肝脏单核细胞，表明机体外泌体的快速摄取和清除主要是由肝脏完成的；在该实验中，血清外泌体浓度峰值在注射5 min后，而30 min后循环中已几乎测不到外泌体，表明了外泌体在体内的快速生物学分布和代谢过程。此外还有研究表明，EVs携带的miRNA-146a和miRNA-155可调节小鼠对内毒素引发的炎症反应[17]。总之，这些研究表明以肝脏细胞为靶点的外泌体广泛参与了肝脏多项生物学进程。
叁
EVs在各种肝脏疾病中的作用
关于EVs在各种肝脏疾病如病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、药物性肝损伤（DILI）、肝纤维化及肝癌等中的作用已有多篇报道，本文不再赘述。
肆
EVs可作为肝脏疾病诊断的生物标志物
4.1 以EVs作为生物标志物的优势
寻找生物标记物是肝脏疾病的一种早期诊断方法，可用于监测和评价各种肝脏疾病的诊疗情况。虽然肝脏活检仍然是诊断肝脏疾病的金标准，但生物标记物在肝脏疾病的无创检测和判断分期方面仍有很广泛的应用，如利用“体液活检”寻找生物标记物，可以减少或者避免对肝脏的有创检查。目前，肝损伤程度评估多基于血液肝脏酶谱检查，如丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰氨基转移酶(GGT)。然而，这些传统酶类标记物对肝脏疾病诊断特异性欠佳，也不能反应肝病的进展阶段或肝细胞损伤程度。因此，寻找新的诊断肝脏疾病的生物标志物很有必要。
EVs在肝脏疾病中作为生物标志物有以下优点：
（1）由于外层有膜覆盖，EVs可保护其内的蛋白质和核酸不被降解。
（2）EVs富含特异性选择标记物，这些标记物在体液的总蛋白组中只占了很少的一部分（＜0.01%)[18]。这种诊断分子富集的优势使EVs有能力检测到现有检测手段难以检测到的低丰度核酸或蛋白质生物标记。
（3）EVs作为生物标志物，与总血浆或血清相比，将降低化验分析的复杂性。
（4）EVs的数量反映了组织中细胞新陈代谢的快慢，对其携带物进行分析可以为疾病进展、恢复和药物反应提供直接的信息。
因此，探索新的EVs中核酸和蛋白生物标记物可为评估疾病进展、预后和治疗反应开辟新的途径。EVs中特定蛋白质或核酸水平也可作为生物标志物用于检测不同的肝脏疾病，然而在现有的独立研究中还无一种生物标志物在临床上得到验证，亦少见关于这些生物标志物在肝病中敏感性和特异性的研究报道，相关应用仍有待进一步研究。
4.2 外泌体中蛋白质作为肝脏疾病生物标志物的潜在应用
有关将EVs中蛋白质信息应用于肝脏疾病生物标志方面，已有数种蛋白获得了认可，包括全长可溶性受体型酪氨酸蛋白磷酸酶γ(sPTGRG)、结缔组织生长因子（GTGF）和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)等。在人和大鼠的血浆中，与EVs有关的sPTGRG亚型已经被认定为肝脏损伤的生物标记物[19]。分别对低ALT水平(ALT<40 U/mL)或高ALT水平(ALT>450 U/mL)人血浆样品观察后发现，血浆中sPTGRG水平与肝脏的损伤程度呈正相关[19]。EVs还被证明是CFGT的传送器：其可在HSCs间传递CTGF并放大纤维增生信号。有研究发现，含有CTGF的EVs可作为一种非侵入性的蛋白质生物标记物来评估肝纤维化的严重程度[20]。在一项蛋白质组学研究中，从人工培养的肝细胞中分泌以及肝损伤的小鼠血清中提取的EVs，一些肝脏特异性蛋白的水平有所增加，如氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、SMAS和儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)；通过对部分肝切除的小鼠进行观察后发现，SAMS的上调是肝脏组织再生的必要条件[21]。利用亲和力分离的方法，可以从肝细胞癌患者血液循环的EVs中分离出特异性单克隆抗体。这些肝脏特异性循环EVs的水平在患者体内有所增加，并与肝癌的大小密切相关。在另一项对急性肝损伤动物模型尿液样本的研究中，发现差异表达蛋白质CD26、CD81、SLC3A1和CD10，可作为肝病的生物标志物。在对D-氨基半乳糖急性肝损伤患者进行治疗时，通过对小鼠尿液中EVs检测发现，一些通常可在尿中明确地检测到的蛋白质数量明显减少，表明尿中EVs的蛋白质携带物可以反映肝脏的损伤程度[22]。
4.3 外泌体中核酸作为肝脏疾病生物标志物的潜在应用
与EVs相关的核酸，特别是miRNAs作为多种肝脏疾病的生物标志物，已引起了广泛关注。研究表明miRNAs可以为肝癌的潜在生物标志物，与肝癌经肝切除术后未复发的患者相比，肝癌术后复发的患者血浆中外泌体内miRNA-718表达明显减少。对一个独立患者队列进行的研究表明，miRNA-718水平的下降与肝细胞肝癌（HCC）肿瘤的高侵袭性相关[23]。肝癌患者含有miRNA-21的血清EVs水平与EVs耗竭血清相比有所增加，和健康人及慢性乙型肝炎患者相比，HCC患者血清外泌体中的miRNA-21的水平较高。虽然血清miRNA-21表达水平在肝硬化后肝癌中的诊断价值早已获得认可，但EVs中miRNA-21相较而言具有更高的诊断敏感性[24]。
不同程度的乙醇性肝损害，或者对乙酰氨基酚或Toll样受体(TLR)9配体［胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG）和脂多糖（LPS)］肝损害模型中，血清和血浆中miRNA-122的水平随着血清ALT水平的升高而增加。患有与炎症相关的肝病（如乙醇性肝损害或CpG和LPS处理后的肝损害）的小鼠体内，miRNA-155和miRNA-146a等炎症相关miRNAs在血清和血浆中均有升高[25]。在模拟乙醇介导的肝损害如乙醇性肝损伤或CpG和LPS处理后的肝损害模型中，血清及血浆miRNA-122和miRNA-155则主要与小鼠体内的EVs丰度有关；与健康的个体相比，急性酒精性肝炎患者循环EVs的数量也有所增加。通过与健康个体对比并针对每个人分别建立的基础基线水平后发现，酒精性肝炎患者或酗酒后，EVs的数量和囊泡中miRNA-122的水平均大幅提高。miRNA-192和miRNA-30a在长期饲饮乙醇的小鼠或慢性酒精性肝炎患者的血清中提取的EVs中表达均升高。在这些miRNAs中，miRNA-192对酒精性肝炎的诊断准确性最高[26]。综上所述，EVs中核酸水平可以作为各种肝脏疾病诊断及判断其严重损害程度的生物学标志物。
伍
EVs作为肝脏疾病的治疗方法
使用EVs特别是外泌体，可作为药物干扰RNA(RNAi)的潜在有效载体。生物相容性和对核糖核酸酶和朊酶类的抗性及转移的稳定性使EVs成为药品的理想载体，否则蛋白质、miRNA、沉默RNA(siRNA)等其他分子会迅速降解。EVs为组织针对性的siRNA和miRNAs调控基因在靶细胞中表达提供了一条新途径。研究证实肝脏是静脉注射后EVs主要的摄取部位[16]，表明EVs在信息传递中的潜在用途及以RNA为基础的靶向RNA干预疗法在肝脏疾病中的应用潜力。有研究发现，EVs在体内外均可有效地向巨噬细胞和肝细胞提供miRNA-155过表达或抑制信号[16]。miRNA-155早已被证明是一种调解人酒精性肝病和肝脏炎症的重要物质，但如何靶向运送miRNA-155仍是相关应用的主要障碍。一项新近研究选取来自B细胞源的EVs（其miRNA-155的天然水平很低，被视为外源miRNA-155合成模拟信号并抑制RAW巨噬细胞的理想载体）并传递miRNA-155至靶细胞，发现对miRNA-155的干预诱导了RAW巨噬细胞的抑制，并使肿瘤坏死因子（TNF）蛋白活性产物下降超过大于50%[27]。提取miRNA-155敲除小鼠体内的肝细胞后发现，EVs能成功地向肝脏传递一个外源性的miRNA-155模拟信号[16,27]。
有研究表明，EVs参与了修复组织和器官损伤，这也可以解释其在干细胞治疗中的旁分泌效应[28]。EVs的内容物可以引起细胞的聚集、分化和增殖，在动物模型中，间充质干细胞（MSC）衍生的EVs可在DILI诱导白细胞介素6（IL-6）-转录激活因子3（STAT3）通路及细胞周期进程中促进肝细胞再生[28]。在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型中，源于人脐带MSC的EVs可减轻肝纤维化，其机制可能与减少表面纤维形成，减少Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的产生，降低血清转化生长因子β（TGF-β）与血清AST的水平有关[29]。利用干细胞衍生的EVs替代干细胞植入物可能为肝脏再生疗法提供了一种新手段，其优点包括：（1）使用来自于肝细胞的EVs，而不是细胞本身，避免了对异常干细胞的诱导分化，避免高免疫反应的风险。（2）与免疫抑制相关的某些类型的EVs可以促进肝组织再生。（3）EVs和外泌体可从血液中分离出来并储存，保持其长久以来的生物学特性，促进其在后期肝再生中发挥作用。尽管EVs为避免在再生医学中使用活细胞而引发的并发症提供了希望，但是MSC衍生的EVs在已知的前致癌物及其抗癌特性等方面还有待进一步研究。
问题与展望
EVs是一种新近发现的潜在生物标记物，但在肝脏疾病诊断、预后判断和预测价值中的作用尚缺乏足够的证据。有必要进行独立的综合研究及具有良好特征患者群体的整体评价，这样才能充分证明EVs生物标志物在临床应用中的敏感性和特异性。有关肝脏疾病中EVs生物标志物的相关研究不应该仅局限于miRNAs，还应涉及包括长链非编码RNA在内的其他核酸及蛋白质和脂质标记物。关于EVs生物标记物的提取、鉴定和处理分析方面的挑战仍然存在，充分利用现有的不同提取技术并对这些技术的优化是下一步研究的重要方向。
以EVs为媒介进行信息传递并干预肝脏疾病进程还存在许多问题：
（1）在EVs用于人体治疗之前，EVs的标准化和质量控制将必须考虑到工业生产及监管的标准，同时还要兼顾大规模生产的制造成本；
（2）因为EVs的内容物不同于亲代细胞的类型和状态，对所提供外泌体类型的选择将至关重要，应根据受体细胞的类型和目标分子进行筛选；
（3）虽然临床试验已经证明自体EVs在重复使用后仍有很好的耐受性，但EVs在肝脏疾病临床治疗的效果依然缺乏随机对照试验的评价，此外EVs介导的信号转导在肝脏疾病发生和发展中的相关性研究也须证明其有独特的治疗靶点。
综上所述，EVs含有多种功能性生物大分子，包括蛋白质、核酸和脂类等，在肝脏不同细胞间的传递信息过程中具有举足轻重的作用。EVs可以通过激活受体细胞中不同的信号通路来改变其功能，从而对各种肝脏疾病的发生和进展机制产生影响。体液中的EVs正在发展为一种潜在的肝病生物学标志物与治疗监测的新手段。此外，在不久的将来，EVs也许会成为一种治疗各种肝脏疾病的新方法。
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