神经再生：一个异常颠簸的发现之旅

2021未来科学大奖周科学峰会【生命科学】RNA 生物学，未来医疗新方向专题，美国加州大学圣地亚哥分校细胞和分子医学系教授付向东教授作了专题分享《神经再生：一个异常颠簸的发现之旅》。付向东教授是一位长期从事RNA基础生物学研究的科研工作者，大约十年前他遇到了一个意想不到的观察结果，即敲降一个称为 PTB 的 RNA 结合蛋白能够将多种类型的细胞转化为神经元。这揭示了一种新的将非神经元细胞转分化为神经元 “减法”策略。他们最近在大脑中进一步探索了这种策略，证明敲降PTB确实能够产生新的多巴胺能神经元，并有效地逆转了帕金森疾病。虽然他们的发现一路上都受到了挑战和质疑，但他们把这些挑战和质疑看作推动科学向前发展的驱动力。

付向东

美国加州大学圣地亚哥分校细胞和分子医学系教授

2021未来科学大奖周科学峰会

付向东教授主题演讲

《神经再生：一个异常颠簸的发现之旅》

RNA研究发展史

提到RNA生物学，目前国内的科研非常热火，但是我记得十几年前它几乎是个没有人问津的领域。但是在国外，从70年代初开始，特别是在近几十年，RNA生物学一直是生物学研究的主流。好在国内近十多年来陆续有科学家认识到RNA的重要性，进入到这个领域，推动了国内RNA研究的发展，取得了可喜的进步。

图一 RNA发展史

图一中列的是一系列RNA研究重大发现的里程碑。在分子生物学的研究中，最初RNA被认为只是一个信使作用，是从DNA到蛋白质中的一个过客。可是通过多年的深入研究，RNA的功能逐渐被发现，现在看来完全不是那么简单。从1975年大卫·巴尔的摩和霍德华·特明发现RNA可以逆转，已表达的遗传物质反过来变为遗传物质。到后来RNA被发现可以作为有催化活性的大分子，接着又发现RNA所有基因都是由分段基因组成的，而不是一个完整的链条，完整的信息必须通过剪接完成。最近又发现RNA的干扰，为医学研究开创了大片的新天地。RNP是RNA和蛋白结合的复合物的缩写，它对癌症和衰老有很大的重要的作用。核糖体作为RNA跟蛋白质组成的机器，它真正起催化作用的是RNA。我觉得很值得一提的是施一公教授解析的剪接体，揭示了这个几乎是大分子里面最复杂，动态性最高的分子机器，但是它的催化机制其实都是RNA来完成的。大家知道去年的诺贝尔化学奖颁发给做基因编辑的CRISPR系统，我想在不远的将来，也许诺贝尔奖就有可能是再一次颁给RNP机器。所以我觉得RNA的研究真是如火如荼，希望年轻的在座的观众投入到RNA的研究来。

RNA与神经退行性疾病

现在我们的讨论从RNA过渡到神经退行性疾病。首先我们来了解什么是神经退行性疾病。神经退行性疾病是由神经元死亡引起，随着年龄增加而出现的一系列疾病，例如阿尔茨海默症（AD）、帕金森病（PD），亨廷顿舞蹈症（HD）、肌萎缩性侧索硬化症 （ALS）， 等。它们是非常富有挑战性的疾病，其病因目前尚不明确也无法治愈，严重威胁着人类健康与日常生活。这类疾病跟衰老几乎是手拉手的过程，是人类共同面临的问题。这个挑战的复杂性有多大？到目前为止，全球有数以千万计的人受到此类疾病的困扰，却没有什么有效的方法可以延缓或治愈。除了有限的成功以外，比如通过反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASO）治疗骨髓性肌肉萎缩症在2016年取得了成功，大多数曾经被寄予很大希望的治疗神经退行性疾病的药物一个接一个相继宣告失败。即使一些药物得到了FDA的批准，但是实际上存在很大的争议，因为效果实在有限。剩下的几个新药，今年在大规模临床实验中相继失败了。当人类进入老龄化的社会，面临的巨大挑战就是怎样来应对这些老年退行性疾病的问题。

这里首先要提到肌肉萎缩症的攻克就是得益于RNA研究的进展。从理论基础开始，肌肉萎缩症的病因是在SMN1基因上发现的功能缺失突变而导致。有意思的是，人类有一个备用基因SMN2，它跟SMN1一模一样，除了在第七个外显子上有一个点突变。这个点突变造成了外显的剪切效率只有20%左右，导致只有约20%左右的RNA能翻译成正常蛋白。虽然20%的蛋白足以提供大部分细胞所需要的功能，但在运动神经元里面就远远不足以维持其功能，从而造成肌肉萎缩疾病。这个方面的攻克，得益于中国科学家华益民和我在冷泉港的师兄Adrian Krainer的研究，利用小RNA分子来干扰这一过程，大大提高了外显子的剪切效率，导致疾病的缓解，拯救了很多人的生命，这是一个里程碑的工作。

肌肉萎缩症相对来说还是简单的，从发病机理到功能修复的科学问题比较清楚明了，但对于大脑的损伤即神经退行性疾病就更具有非常大的挑战性。除了经典的做法以外，一个新的思路就是想办法，能不能升级我们的大脑？用新生的神经元来代替失去的细胞。这里不光是挑战性的问题，而且是颠覆对神经系统认知的问题，从传统的观念来说，神经是不可再生的。但问题的是神经究竟可不可以由别的细胞转变而来，神经的回路到底能不能重建。实际上我们是误打误撞进入这个领域的，或者是用中国一句话，无知则无畏。我们是神经领域的新兵，才可能敢于打破常规，解放思想，做一些大家认为不可能的工作，从而得到意想不到的结果。在这里和大家分享一下我们这方面的工作心路历程。

在小鼠帕金森病模型中，原位转化神经元逆转，通过敲降PTBP1基因， 我们在大脑黑质区产生了新的多巴胺神经元，从而使得小鼠恢复大脑功能。这是去年六月份我们在Nature上发表的工作，后面我会详细讲到。这个工作发表以后，造成了很大反响和轰动，轰动的同时也遭到了一系列的质疑。包括最近 Cell 上的一篇文章就说新生神经元由什么细胞转变而来尚不太清楚。也有人做敲除PTBP1基因，证明这个基因并不起作用。在 Science 的博客上有人说，不能冒进，也许看到的都是假的东西。包括中文圈子里面专门组织了一个科研吐槽大会，讲新生的神经元是不是上帝之手创造的，意思就是说这是不是一个编造的东西。科学有意思的地方也在这里，一个重大的发现，总会有人觉得有道理，有人提出质疑，科学正是在这种不断的争论当中得以前进。所以今天想利用这个机会，跟大家分享我们这个发现的心路历程。我们原来不是做神经的，只是科研的需要，我们在研究的过程中一个偶然的发现，诱导我们进入这个全新的领域。所以我不认为我是一个神经科学家，至少现在来说不是，我们还有很多东西要学。

故事的开端：体外转化

其他类型细胞为神经元细胞

这个故事从哪里开始呢？就从薛愿超开始，他是我在武大的博士生，后来在美国我的实验室做博后，现在是北京生物物理所一个非常成功的研究员。在读博期间，我们的一个研究课题是研究PTBP1在RNA剪切调控中的作用，这是一个非常基础的生物学问题。出乎意料的是，我们发现当把这个基因敲降以后，HeLa细胞都变得有点像神经元了，并有部分神经因子基因表达。后来我们将实验扩大到其它细胞系，发现所有的实验细胞中只要缺少PTBP1后都可以变成神经元，这是一个非常意想不到的发现。

图二 敲除PTBP1诱导出神经元的机制

我们是做分子生物学的，经过一系列的实验，我们把其中的机理弄得很清楚了，这里大概跟大家讲讲。在神经元的发生过程中有一个叫REST复合物。这个复合物控制了很多神经元特有的基因的表达，包括一系列的小RNA（microRNA）的表达，其中最重要的之一是miR-124。而miR-124反过来又可调控REST相关成分基因的表达，于是形成一个反馈的环路。在正常的非神经元细胞里面，REST高，miR-124低，形成稳定的负反馈环路。miR-124偶尔上升也不能起作用，因为刚好PTBP1起到一个刹车的作用。在神经发生的时候或者通过人为敲降以后，PTBP1表达量会下降，于是刹车没有了，一点点miR-124的变化可以导致REST组成成分下降，REST下降又会进一步诱导miR-124 的表达，于是整个机器就启动了。有意思的是，这个环路就像一个电瓶，发动机由电瓶启动以后，剩下的就是自己转了，最后导致了一系列神经基因的表达，从非神经细胞转变成神经细胞。当我们检查细胞中关键基因的表达时，发现在PTBPI敲降情况下，所有已知的用于将非神经细胞转变成神经细胞的转录因子，都被诱导出来了。所以一个PTBPI敲降可引导一连串的连锁反应，导致细胞的命运从非神经细胞转化成神经细胞。

当这个发现发表以后，立刻受到了质疑，而且质疑的还是这方面的领军人物——Rusty Gage。

他们很快重复了我们的工作，并且发现这些类神经元的细胞中没有成熟神经元标记基因MAP2的表达，因此得到的结论是转化的神经元不是成熟的神经元。

他们认为实验体系存在问题，不再继续往下做了。

然而我们将这个质疑变成探究真相的动力。

我们意识到他们的实验是人的成纤维细胞，我们发表的实验是在小鼠的成纤维细胞中进行的，二者可能有着根本的区别。

当成纤维细胞里PTBP1基因被敲降，会诱导nPTB or PTBP2 这个兄弟基因的表达。

在小鼠中nPTB表达后会自己慢慢降低，但在人细胞里nPTB上升以后就不下来了，我们猜想很可能这就是我们与Gage实验室所得不一样的结果的关键所在。

经过一系列的努力，我们发现一个另一个由nPTB调控的环路，在这个环路中，PTB下降以后，nPTB被诱导表达， 从而抑制BRNA2的表达。BRNA2是成熟神经元功能所需要的转录因子，其中一个重要的靶点是另外一个小RNA，miR-9，这个小RNA同时也可以调控nPTB的表达。从非成熟神经元变成神经元的过程中，BRNA2的升高会诱导miR-9产生，miR-9进一步降低nPTB的表达，从而不能抑制BRNA2，导致其表达得更高。慢慢循环起来以后，一系列跟神经元功能有关的基因就诱导了。由此可见，要产生有功能的神经元，就必须严格按顺序来激活两个基因调控的通路。这些机理解释了我们与Gage实验室结果不同的机理，也回答了别人质疑，

为什么把PTBPI敲除掉以后没有成熟神经元？这是因为PTBPI敲除后诱导了PTBP2，而PTBP2上来以后就不下去了，因此抑制BRNA2环路，从而抑制一系列跟神经元功能有关的基因的表达，所以说敲除和敲降是完全不同的两个生物学概念。

非神经元到神经元细胞的体内转化

图三 走向神经元的 两扇门

继这个工作之后，钱浩加入了我们实验室，开始了他的博士后研究。

现在钱浩已经回到了国内，在电子科大做教授。

他当时的兴趣是，大脑里面的神经元和非神经细胞，它们之间在这两条通路里面的关系。

长话短说，图三显示，他发现第二个通路在神经元和非神经细胞几乎是一样的，但在第一个通路在两者之间有本质上的区别。

miR-124在神经细胞很高，但是在神经胶质细胞里面很低，反过来PTBP1和REST在神经

胶质细胞里很高。

所以说他认为，胶质细胞里面一扇门是关着的，另一扇门则是开着的。

能不能通过敲降PTB来打开这一扇门，进而产生功能性的神经元呢？

果然，当他把星形胶质细胞从大脑里提出来，把PTBP1敲降以后，很快转换成神经细胞了。

我们进一步探讨看看这种转化能不能在大脑里面实现，实验结果表明确实能够做到，我们在帕金森小鼠模型中进行了一系列的实验。

图四 敲降PTB在小鼠中治疗帕金森

图四右是一个野生型老鼠，在左脑和右脑里面可看到与帕金森有关的多巴胺神经元末梢和胞体。通过化学的办法，把多巴胺神经元去除以后，这个老鼠就会产生跟帕金森有关的症状。通过神经再生，可以把多巴胺神经元恢复1/3，多巴胺恢复了60%左右（图四左）。

当这个成果发表以后，引起了巨大的反响，却也又受到质疑，比如张春立实验室近期在 Cell 发表的工作。

他们的实验策略是：

采用Cre转录方法将YFP 先表达在神经胶质细胞中，然后采用与我们相似的方法用AAV病毒导体将shPTBP1导入神经胶质细胞以达到敲降PTBP1的效果，然后观察是否有新的YFP追踪的神经细胞产生，图五是他们的实验数据。

图五 体内追踪星形胶质细胞向神经元的转换

图中Aldh1l1是星形胶质细胞特异的启动子，表达可由Tamoxifen激活的 CreER，表达以后就可以把星形胶质细胞用YFP标记上，然后将表达红色萤光的mCherry加 shPTBP1或对照用的shLuc病毒（AAV）导入大脑中。

有意思的是，这个结果重复了我们的结果：有shPTBP1就有更多的神经元产生。红颜色是表达mCherry的细胞，同时也表达内源的神经元的标记物。可是这些神经元不表达YFP，表明这些神经元不是由Aldh1l1标记的星形胶质细胞而来。但仔细看这个实验设计发现， 任何mCherry标记的细胞就应该有Cre的表达，因而就应该表达YFP才对，可是在很多细胞里面就是没有YFP（由红色的mCherry但没有绿色的YFP）。不光是PTBP1敲降细胞里面，在对照里面同样有很多这样的细胞。这就提示我们，有可能存在不同的神经胶质细胞，表达的Aldh1驱动的Cre蛋白水平不一样，从外源进入的mCherry DNA很容易表达，但是内源在染色质上的YFP就比较困难。后天的神经科学讨论会上，我会跟大家专门讲具体的机制。更为重要的是，意识到可能存在不同的神经胶质细胞给我们今后的工作指明了方向。

神经元细胞转化在临床上的应用前景

虽然是挑战，但让我们想到了很多的科学问题作为下一步的研究方向。

更重要的是，不但能够产生神经元，而且发现这个神经元重建了受损伤的神经回路。

我们通过跟北京大学的周专和康新江教授合作，将电极插到大脑的黑质区，这是多巴胺神经元产生的地方，另一个电极插在纹状体，来记录电刺激产生多巴胺的释放。

在正常的大脑一侧信号是很强烈的，失去了多巴胺神经以后这个现象就失去了。

当我们恢复了神经回路后，信号也回路了。

在动物实验中，两组表现出帕金森症状的老鼠，一组做手术，手术后大家可以看到，由于老鼠大脑一侧受损，它会不停地顺时针旋转。

另一组通过修复实验，将PTBP1敲降，产生多巴胺神经元之后，老鼠就痊愈了，而且效果是终身的。

这篇文章发表以后给很多患者带来了希望，每个星期我都会收到全世界病人的来信。

有些信写的非常感人，跟大家分享一下。

其中《请您和帕金森患者一起点燃生命之光》是一个有几百位帕金森患者的群体给我们的来信。

他们写到：

“多少人期盼干细胞移植或基因治疗能快一点，再快一点，我们真的有时候觉得生不如死的感觉，我们需要你们这些科学家、科技工作者给我们一线希望，给我们一个研究计划都可以，我们太需要这个了。 ”

大家想想，当你看到患者这样的来信，你会觉得，作为一个科学家，你所做的工作不是为了发几篇文章，而是有一种社会的责任，一种使命感。

我们应该继续在这条路上走下去，给患者带来希望。

这就是下一步要开展的工作，希望从老鼠扩展到灵长类，一旦证明在灵长类有效就可以开始临床试验了。

我今天所讲的这个故事是给大家一个提示，从事基础科研，就应该捕捉现象，然后深入研究下去，突破一个个关键问题。

回过头来，现代神经生物学的创始人，19世纪西班牙的科学家 Santiago Ramón y Cajal 通过显微镜下的观察，对大脑的微观结构有着开创性的研究，他手绘的神经元首次为人们展现出神经细胞的样子，在教科书中沿用至今。

Cajal写道：

“In adult centers the nerve paths are something fixed, ended, immutable. Everything may die, nothing may be regenerated.”这个思想指导了一个半世纪的神经科学，神经是固定的，不能再生的。

但他同时也指出“It is key for the science of the future to change, if possible, this decree.”意思就是说不能把话说死了，科学的发展随着研究的深入，一切教条都有可能改变，这就是这位现代神经生物学之父的伟大之处。

我们如今的科研不能围绕着教条来，要勇于创新。

许多创新都是一些“无知”的人干的，无知才无畏，也许歪打正着。

回头看看生物学许多的重大发现都是经过开始的不经意，后来的重重质疑，再后来的层层剥茧中创造出来的。

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