婴儿期非灵长类动物异氟烷暴露影响青少年期社会行为但非认知功能

摘要

背景：临床研究表明，婴幼儿时期短时间内暴露于麻醉药的儿童在以后的智力测验中表现正常，但其社交行为却发生了变化。在非人类灵长类动物（NHPs）中，婴儿动物接受数小时麻醉会导致神经行为受损，包括运动反射发育迟缓以及焦虑相关行为增加。但是，麻醉是否会影响青少年NHPs自发性社会行为目前尚不清楚。我们假设婴儿期NHPs多次（每次5小时）而非单次暴露于异氟烷会导致特定的认知功能损伤并影响青少年NHPs的社会行为。

方法：出生后6-12天恒河猴（每组8只）分别接受异氟烷麻醉1次（1×组）或者3次（1×组），每次麻醉时间5小时；对照组于室内吸入空气。在恒河猴其两岁内进行认知功能测试，家庭环境中的行为学评估以及诱发反应试验。

结果：在认知功能方面，各组之间无显著差异。然而，与对照组相比，接受异氟烷麻醉3次的NHPs表现出较少的亲密社交行为（P = 0.016），而接受1次麻醉的NHPs与焦虑相关的行为增加（P = 0.038），且更加不愿意接触新事物（P <0.001）。

结论：婴儿期NHPs多次接受5h异氟烷麻醉与青少年期亲密社交行为降低有关，接受单次5h异氟烷麻醉与焦虑行为增加有关。但无论是单次麻醉还是多次麻醉均不影响认知功能。我们的发现与临床研究中报道的麻醉对社交行为的影响是相吻合的，这也许可以进一步指导我们未来研究。

背景

对于婴幼儿接受全身麻醉后是否会损害神经发育，现有的回顾性临床研究并没有得出一个一致的结论。目前，针对婴幼儿接受麻醉后对神经系统影响的大规模临床研究GAS（General Anesthesia compared to Spinal anesthesia）、PANDA（Pediatric Anesthesia Neurodevelopment Assessment）、Mask（Mayo Anesthesia Safety in Kids）发现，在婴儿期接受1-2h麻醉对其智力（IQ得分）无明显影响。而根据父母和照顾者使用行为调查表和检查表的报告得出的次要结果显示，婴儿期暴露于全麻药后到其学龄期的执行功能或行为发生了变化。

在非人灵长类动物（NHPs）中进行的基础研究表明，在生命早期进行一次全身麻醉会

导致发育中的大脑神经元和少突胶质细胞迅速广泛地凋亡。受影响的大脑区域包括那些参与社交行为的区域，例如杏仁核，前额叶和扣带回皮层。在NHP中研究发现，新生NHPs暴露于吸入麻醉药3次后在其6个月时焦虑相关的行为增加，这种焦虑行为在其在1岁和2岁时仍很明显。在以往的有关NHP暴露于全身麻醉药物研究中，大多数行为学测试来自激发反应试验，并没有评估动物在家环境中自然或自发的社会行为。最近临床研究表明，婴儿期单次或多次暴露于全身麻醉药均可以引起儿童期在家或学校的自发行为学改变。在本研究中，我们将观察出生2周内NHPs单次或多次暴露于异氟烷对其2岁时在其熟悉环境中行为学影响。此外，我们采用还苹果单次或多次暴露异氟烷对其认知功能的影响。我们推测婴儿期接受多次（而不是一次）5小时异氟烷麻醉与青少年NHPs中的认知功能受损和社会行为改变有关。

方法

动物饲养

出生时体重为0.4-0.5千克的恒河猴（猕猴（Macaca mulatta；12只雄性和12只雌性动物）饲养于俄勒冈州国家灵长类动物研究中心ONPRC。在恒河猴1岁以内，它们被饲养在室外130 m 2 围栏内，围栏里有30-50只恒河猴。在这些恒河猴1岁时，它们从母体断奶，并从原有恒河猴群体迁出，到一个新的恒河猴群体，每个恒河猴群体有5-6只研究对象。每个恒河猴群里包括不同性别以及不同社会等级的恒河猴。每一组恒河猴群体被安置在约16 m 3的室内围栏或“家庭笼子”中。这些家庭笼子位于不同的动物房中，总共可容纳32只猴子，包括其他非实验性猴子。每天两次给动物喂商业猴饲料、补充谷物或农产品，并且可以随意饮水。将动物暴露于12：12h的光亮与黑暗周期中。在2岁时完成所有认知和行为评估后，研究对象使用戊巴比妥钠（120 mg ·kg -1，iv ）处以安乐死，灌流其大脑以备将来进行组织学研究。

麻醉实施

在实施异氟烷麻醉前一天，新生恒河猴及母猴被转移到一个新的笼子中提前适应环境以减轻焦虑情绪。新生恒河猴分为3组：对照组、异氟烷麻醉1次组（1×组）异氟烷麻醉3次组（3×组）.新生恒河猴在自主呼吸情况下通过面罩吸入一定的异氟烷。待麻醉达到一定的深度后，进行气管插管及机械通气。吸入氧浓度为30%，控制呼气末异氟烷浓度为0.7-1.5 vol%，麻醉时间为5h。每15分钟监测恒河猴生命体征并针对其异常情况进行处理。麻醉结束一般10min内拔除气管导管。恒河猴随机在出生后第6天（P6）接受异氟烷麻醉1次或者在P6、P9、P12接受异氟烷麻醉3次。对照组恒河猴除了吸入空气之外，其余程序相同。

认知功能评估

大多数认知相关行为学测试在恒河猴1-2岁之间进行。主要包括如下几项测试：

延迟反应任务

延迟反应任务主要用来评价空间记忆。在此实验中，恒河猴首先看到实物被实验者放进桌面上两个凹槽其中的一个，然后两个凹槽同时被7cm方形黑色盖子盖住。紧接着在猴子和桌面之间放置一块不透明的屏幕，使猴子看不到桌面。这一期间称为延迟期。延迟期结束，实验者拉起帘子，让猴能看得到桌面，可以翻开盖子取食。如果猴子翻开了错误的盖子，则屏幕迅速关闭以防止猴子拿得到食物。记录猴子正确取得食物的次数。

逆向学习和设置转换任务

通过一系列视觉识别实验来评价NHPs对刺激的反应学习能力，执行能力以及认知的灵活性。测实验主要由以下几个任务组成，当NHPs做出正确的选择时便会得到食物。（ⅰ）NHPs首先学会在三角形和正方形中选择。其中三角形是正确的选择，做出正确的回应会得到食物。刺激物体紧接着随机呈现红色或者绿色，但是颜色和任务并不相关。（ⅱ）当NHP在此任务中能达到80%正确率，开始逆向学习实验，即之前不正确的选择如正方形成为正确的选择。（ⅲ）第三个阶段是设置转换任务，刺激物体颜色和选择相关，绿色是正确的选择，NHPs需要忽略刺激物体本身的形状。最后，正确的颜色变为红色。每个任务NHPs进行40次训练，直到达到80%正确率。记录恒河猴所需要学习的天数以及做出错误选择的次数。

糖果取回实验

该实验主要用来评估精细运动技能和视觉空间能力。在训练阶段，NHPs被训练从一根直的金属棒上拿掉一个环形的坚硬的糖果（Life SaversTM）。在测试阶段，NHPs被要求从不同角度弯曲的金属棒中取回糖果。记录每次获得糖果所需的时间。

行为学测试

在恒河猴2岁时进行行为学测试，行为学测试主要包括以下几项：

基于家庭环境的行为学评估

在2-3周内，由训练有素且经验丰富的观察员观察并记录恒河猴的自发行为，包括焦虑，屈服行为，侵略行为等。观察时间每次10分粥，每周进行2-3次，每只动物观察60min。

人类入侵者实验

在实验期间，将NHPs置于一面为透明PE板的猴笼中，在前方约60cm处放置高清录像机。首先进行2min的基线录制，此阶段没有人类入侵者存在。然后人类入侵者需佩戴陌生面具以及披风暴露在动物视野钱，并依次展现3个角度，各进行2min视频录制，包括侧面（展示轮廓，没有目光接触）、正面（正面持续目光接触）、背面（背对动物）。量化NHPs的各种行为反应时长。

新物体识别实验

将新物体放入笼中，每个物体放置5min。记录NHPs检查、触摸或操作新物体的行为，量化各种反应时长。

结果

在NHPs 1-2岁时，我们对其认知功能进行测试。在延迟反应任务中，如图1A所示，所有组恒河猴，无论是单次麻醉还是多次麻醉，其正确率随着时间的延长而下降。接受3次麻醉的恒河猴（3×组）在该任务中正确率最低。但每个时间点各组恒河猴之间正确率无明显统计学差异。在逆向学习和设置转换任务中，我们可以发现，各组恒河猴在各项任务中达到所需正确率的学习天数差异无统计学意义（图1B）。同时，各组恒河猴在各组任务达标之前所发生的错误选择次数无统计学差异（图1C）。在精细运动技巧和视觉空间能力方面，我们通过糖果取回实验发现，各组恒河猴在取回糖果所需的时间方面差异无统计学意义（图1D）。

图1 新生NHPs接受异氟烷麻醉后对其认知功能的影响。A 延迟反应任务；B、C 逆向学习和设置转换任务；D 新物体识别实验。

在NHPs 2岁时，我们对其社会行为进行评价。在基于家庭环境的行为学评估中，我们发现，与对照组相比，3×组恒河猴在其青少年期亲密行为减少，差异具有统计学意义。1×组恒河猴与对照需相比，其亲密行为无明显统计学差异。此外，我们评估了侵略性、屈服性和焦虑性行为，发现在这些方面三组之间无明显统计学差异（图2）。

图2. 各组NHPs在基于家庭环境的行为学评估行为学实验中的表现

在人类入侵者实验中，我们发现，当入侵者未进入房间时，三组恒河猴运动行为无明显统计学差异。在轮廓展示阶段，三组恒河猴运动行为明显减少，差异无统计学意义。在惊吓阶段，1×组恒河猴焦虑相关行为（磨牙行为）明显增加（图3）。

图3. 各组NHPs在人类入侵者行为学实验中的表现

在新物体识别实验中，我们发现，与对照组相比，1×组恒河猴对新物体接触明显减少。而3×组恒河猴与对照组相比，差异无统计学意义（图2C）。

图4. 各组NHPs在新物体识别行为学实验中的表现

讨论

在本研究中，我们探究了出生2周内的恒河猴接受1次或者3次异氟烷麻醉对其青少年期（1-2岁行为学的影响。）以往研究发现，新生恒河猴，单次暴露于异氟烷5h即可引起神经元以及胶质细胞广泛的凋亡，但这种结构的改变是会伴随着以后功能的改变尚不清楚。在本次研究中，我们发现，新生恒河猴单次或者3次暴露于异氟烷并不会影响其认知功能，但对其自发社会行为有一定的影响。

在本次实验中，对认知功能的评估包括空间工作记忆、认知灵活性、执行能力方面，此外，我们还对这个年龄阶段的精细运动能力和视觉功能测试。我们发现，单次或者3次暴露于异氟烷对上述能力无明显影响。与我们的研究结果相似，Talpos等研究发现，新生恒河猴暴露于异氟烷联合一氧化二氮麻醉几乎不会影响其3.5岁时的认知功能。

有研究发现，多次暴露于全身麻醉可能会影响精细运动能力。然而，在本研究的糖果取回实验中，各组恒河猴在取回糖果所需要的时间并无统计学差异，表明精细运动并未受到影响。尽管在我们的实验中，恒河猴暴露于全身麻醉对其青少年期特定认知领域均无明显影响，但是，我们要承认，在不同时间进行行为学测试或者实施不同的认知相关行为学测试可能会有不一样的结果。

新生恒河猴暴露于异氟烷致其青少年亲密行为减少是本研究的主要发现。在恒河猴中，亲密行为从新生儿期开始出现，到2.5岁时发展到高峰。因此，在恒河猴2岁时亲密行为减少可能会对其社会发展功能产生重要的影响。在人类社会中，亲密行为或者社交互动减少可能预示着焦虑或者抑郁行为。尽管在本研究中，我们并没有观察成年后恒河猴的社交行为学，但在青少年期观察到的亲密行为减少可能预示着这些动物在以后的生活中焦虑或抑郁风险大大增加。在生命早期出现焦虑样行为可能会增加以后罹患焦虑或者抑郁的风险。采用人类入侵者实验我们发现，单次暴露于异氟烷可能会增加恒河猴青少年期焦虑行为。与我们的研究类似，Raper等研究发现，新生恒河猴暴露于七氟烷会增加其以后焦虑行为。然而，在本研究中，多次暴露于异氟烷并没有增加日后焦虑行为的发生。因此，未来的研究需采用不同的行为学以评估焦虑的发生来解决这一有趣的现象。

本研究中也存在着一定的局限性。在本研究中，我们选择麻醉时间为5小时，因为我们有充分的证据表明5小时的麻醉会导致恒河猴广泛的神经元及胶质细胞凋亡。但在实际临床工作中，只有很少的新生儿手术需要接受5个小时的麻醉，更不用说连续接受3次麻醉。因此，更短时间的麻醉暴露能否导致社会行为学改变还需要进一步探究。

结论

我们研究发现，婴儿期单次或多次暴露于异氟烷5 h都不会影响认知功能，但是多次接受5h异氟烷麻醉与亲密社交行为降低有关，接受单次5h异氟烷麻醉与焦虑行为增加有关。这些研究结果与近期临床研究报道婴儿期接受麻醉并不会对智力行为产生影响，而会影响其社交行为是一致的。

评述：

全麻药对小儿的发育是否有影响一直是患儿家长和麻醉医师关心的问题。该研究着重探究了NHPs暴露于异氟烷麻醉后对其自发性社会行为而非诱发的社会行为学变化的影响。研究人员发现，婴儿期NHPs多次接受5h异氟烷麻醉与青少年期亲密社交行为降低有关，接受单次5h异氟烷麻醉与焦虑行为增加有关。但无论是单次麻醉还是多次麻醉均不影响认知功能。这个结论与近期发表的临床研究似乎一致。近年来一系列临床相关研究表明，婴儿期接受全身麻醉几乎不会影响其青少年期智力水平，具体评价指标包括IQ值以及认知功能的评估，老师的评价等。这项研究可进一步打消了父母/监护人和所有护理提供者（尤其是外科医生和麻醉医师）使用麻醉药的疑虑。

此研究存在着一定的局限性。由于每组使用的NHPs数量较少，可能会限制检测行为和认知评估中微小变化的能力；每组雌雄比例一致，因此无法确定社会行为学变化是否存在性别差异。此外，NHPs暴露于异氟烷对其神经行为学的影响能够推广到其他麻醉药尚不清楚。

在NHPs模型中研究婴儿麻醉暴露的影响的方法也有很多优点。与其他可用的动物模型相比，NHPs大脑的发育和复杂性与人类大脑最相似。NHPs是高度社交的动物，表现出与人类相似的令人感兴趣的行为，这使该能够研究婴儿麻醉暴露对2岁NHPs社交行为的影响。此项研究发现可提示我们重点关注婴儿暴露麻醉后对其社会行为的影响。

编译：魏恺；述评：邓萌

文献来源：Neudecker V, Perez-Zoghbi JF, Coleman K, Neuringer M, Robertson N, Bemis A, Glickman B, Schenning KJ, Fair DA, Martin LD, Dissen GA, Brambrink AM. Infant isoflurane exposure affects social behaviours, but does not impair specific cognitive domains in juvenile non-human primates. Br J Anaesth. 2021 Feb;126(2):486-499. doi: 10.1016/j.bja.2020.10.015.

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