外科手术促进乳腺癌转移？
作者：周济春
来源：邵逸夫医院乳腺疾病诊治中心
周济春博士
浙江大学医学院附属邵逸夫医院肿瘤外科 主治医师
耶鲁大学与浙江大学联合培养肿瘤学博士，耶鲁大学 博士后
临床方面严格按照循证原则，开展以乳腺，甲状腺，胃肠道肿瘤等常见实体瘤的个体化精准治疗。基础研究方面主要围绕乳腺癌内分泌耐药机制及逆转策略，乳腺癌癌前病变开展转化医学研究
获2017年中国临床肿瘤学会（CSCO）“35 under 35”最具潜力年轻肿瘤医生称号，担任《中华乳腺病杂志（电子版）》中青年编辑委员会委员，《肿瘤综合治疗电子杂志》编委，《转化医学电子杂志》编辑委员会青年编委，Annals of Translational Medicine 专栏编辑
负责和以主要成员身份参与国家自然科学基金课题5项，科技部支撑项目1项及浙江省自然基金项目多项。已发表SCI论文30余篇，包括PNAS, Nature Communications, Oncogene, Nucleic Acids Research，EMBO Molecular Medicine等国际知名杂志，累计影响因子超过120分，被他人引用次数超过600次。
本次分享的文献题目是“The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy（小鼠模型证实手术所致系统反应促进远处受免疫控制的冬眠肿瘤细胞的增殖）”，内容甚是有趣，是发表于2018年4月Science Translational Medicine杂志上的最新研究论文。倘若题目换成更加通熟易懂的表述——“手术促进肿瘤转移”，乍一看会让大部分临床医生和患者大惊失措。那事实真的如此吗？
内容提要
- 乳腺癌临床治疗中有一个“奇怪”的现象，部分患者往往在术后短期内出现远处转移复发。这种在术后12-18个月内出现的远处转移似乎与手术存在千丝万缕的联系，主要证据在于手术与转移复发存在时间节点上的“同时性” 。
- 目前存在两种可能的解释：其一认为手术过程中挤压肿瘤，导致肿瘤细胞脱落，最终在远处发生定植转移；其二认为手术时乳腺癌患者已经存在远处转移灶，只是手术时远处转移灶还不能被常规临床检测手段所发现（亚临床病灶）。
- 如今已有越来越多的证据支持“亚临床病灶学说”，那么手术是如何导致亚临床病灶在短期内增大到临床可检测的程度呢？
- 本期周济春博士解读来自肿瘤研究领域的顶级教授Robert Weinberg团队的最新研究，且看如何创造性的使用动物模型解析这一临床难题及解决方案。
研究背景
这篇研究来自肿瘤研究领域的顶级教授Robert Weinberg团队。对肿瘤基础略有知晓的人应该知道，其汗牛充栋的研究结果我们暂且不提。就单独提“肿瘤十大特征”理论和《the biology of CANCER》这本名著，想必大家都会如雷贯耳。
Robert Weinberg教授团队开展此项研究的初衷主要为了解决乳腺癌术后早期复发转移与手术相关性。他们创造性地提出伤口修复模型（避免对原发灶进行干预），将手术与肿瘤切除分离，发现手术所带来的全身性炎症反应在术后肿瘤复发转移中具有重要作用，而抑制炎症能有效减少早期复发转移。
历史上对手术到底是否促进肿瘤转移存在极大的争议。从流行病学的数据来看，不论分期，不论分子分型的肿瘤，在术后12-18月期间都存在一个复发高峰。这一现象提示手术可能与乳腺癌术后的转移复发相关。那具体什么机制呢？早在1995年发表在Lancet的文章提示，该复发高峰可能与手术导致肿瘤细胞脱落有关。但后续研究提示，乳腺癌手术治疗期间的肿瘤挤压其实非常有限，脱落细胞理论似乎无法解释手术与术后短期内复发的因果关系。亚临床转移灶学说很快就占据了上风。
让我们换个角度看这个问题：研究者选择了乳腺癌术后接受乳房重建（延期重建）的患者作为研究对象。患者在接受重建时，理论上局部已无肿瘤病灶，可以很好地排除手术对肿瘤挤压的影响。有趣的是，研究结果提示，延迟重建组出现复发转移高峰的改变，正好落在了转移复发高峰期（12-18个月内）。此外，研究者还比较了不同手术方式对术后复发转移的影响，结果提示手术越大，复发风险越高（单侧假体vs DIEP、TRAM和双侧手术）。
理论上讲乳腺癌属于全身性疾病，在疾病进程的各个阶段都存在广义的亚临床病灶（休眠期肿瘤），包括微转移病灶、单个脱落细胞、循环肿瘤细胞等。此时常规临床检测手段尚无法发现这些处于休眠状态的肿瘤灶。但在有效的血管供应、免疫逃逸、肿瘤微环境相互作用、生长刺激因子等作用下，本来处于休眠状态的肿瘤逐步增殖生长，进而达到临床可检测的大小（转移复发）。
从去年发表在NEJM上的重磅研究结果，同样提示乳腺癌转移复发的风险持续存在，主要原因可能就是这些亚临床病灶的广泛存在，即处于休眠期的肿瘤。
那么这些原本处于休眠的肿瘤如何被激活，进入快速增值生长状态呢？这一过程是否与手术密切相关呢？ 这就是临床问题如何进行机制探索的典型案例。
只有明确其背后的机制，临床才能进行有效的防治！
首先，是否能对比一组患者手术，而另外一组患者不手术？NO!这显然违背伦理，因为手术已经被广泛证实能有效延长患者生存期。
那么能否在动物模型上做这样的研究呢？由于肿瘤本身会释放各种促生长或抑制远处处于休眠状态的肿瘤灶，此外不同的肿瘤本身存在差异，与手术存在交互作用。因此单独切除瘤灶不能很好的还原手术影响术后短期转移复发的现象。
此外，目前对于处于休眠状态肿瘤的调控存在很多理论假说，比如血管生成学说、动态平衡学说、免疫调控学说等等。其中免疫调控学说进入了Robert Weinberg教授团队的研究视野。会不会是手术促进了原本处于免疫监控的休眠状态肿瘤细胞苏醒，从而进入恶性增殖状态呢？
Robert Weinberg教授团队的研究，运用动物模型明确证实手术和后续的创口愈合,与远处转移灶的肿瘤细胞增殖具有相关性。或者更具体的说，他们的研究发现手术导致的全身系统性炎症反应促进了原本受肿瘤特异性T细胞监控的休眠状态肿瘤细胞进入恶性增殖阶段。此外，他们的研究还显示在此模型中围手术期使用抗炎治疗能显著抑制肿瘤的生长，提示在临床上使用类似的抗炎方法具有显著降低乳腺癌患者术后早期复发转移的可能。
研究者采用了Balb/C小鼠和鼠D2A1乳腺癌肿瘤细胞作为其研究对象。通过基因工程将鼠D2A1乳腺癌细胞改造成D2A1-GFP，即在D2A1乳腺癌细胞中外源性增加了GFP蛋白的表达。实验结果提示原本可以在Balb/C小鼠中容易成瘤的D2A1细胞，经改造成D2A1-GFP后变得不再容易成瘤，提示Balb/C小鼠对D2A1-GFP肿瘤细胞具有免疫抵抗，可能原因为GFP这一抗原所致。简而言之，Balb/C小鼠可能存在某种抑制D2A1-GFP乳腺癌细胞生长的免疫机制。
研究者收集了D2A1-GFP种植瘤模型的相应引流淋巴结分离淋巴细胞进行体外培养，检测肿瘤特异性免疫激活指标IFN-γ，同侧淋巴结内的淋巴结细胞在第7天时即率先出现IFN-γ水平增高。到了第10天时，对侧淋巴结内的淋巴细胞同样出现相较无肿瘤种植组显著增高的IFN-γ分泌。
接下来要问究竟是何种免疫细胞对D2A1产生了抑制作用？结果提示抗CD8抗体（具有抑制CD8+T细胞作用的抗体）能有效抑制D2A1-GFP乳腺癌细胞的增殖。此外D2A1-GFP乳腺癌细胞同样能在通过基因改造后对GFP免疫的Balb/C小鼠模型中顺利生长。上述结果提示普通Balb/C小鼠的CD8+T细胞能够特异性地抑制D2A1-GFP乳腺癌细胞的增殖。
那么CD8+T细胞是否存在免疫记忆（特异性免疫的特征之一）？研究者通过尾静脉注射D2A1-GFP乳腺癌细胞（肺转移模型）发现，既往种植过D2A1-GFP乳腺癌细胞，并且不能成瘤的Balb/C小鼠，肺部形成转移灶的可能性几乎为零。而未种植过的Balb/C小鼠，出现了肺部转移结节。
为证实这一结果，作者根据成瘤成功与否及成瘤大小将既往种植过D2A1-GFP乳腺癌细胞的Balb/C小鼠分成不同组别进行比较，证实了Balb/C小鼠对D2A1-GFP乳腺癌细胞具有免疫记忆作用。
研究过程中发现，D2A1-GFP乳腺癌细胞成瘤后的2-3周内存在一个停止生长的阶段。作者推测此阶段属于免疫监测过程中的免疫平衡阶段，与临床乳腺癌患者存在远处亚临床转移灶的阶段类似。此时在某种免疫调节刺激下，远处亚临床转移灶中处于休眠状态的肿瘤细胞即可打破免疫平衡、逃脱免疫监视，进入快速生长阶段。
结合前述乳腺癌术后早期远处转移的特性，研究者推测是否由于手术后的伤口修复反应所引起的全身系统性炎症扰乱免疫系统对处于休眠状态肿瘤细胞的监控，而导致术后早期出现转移。
为了排除肿瘤切除术本身存在差异，及手术与肿瘤之间存在交互性所导致的混杂因素影响结果的分析，研究者另辟蹊径以手术所致的伤口修复过程为研究对象：采用已被广泛验证能模拟伤口愈合过程的海绵皮下植入——诸多研究已证实海绵植入后，能诱发中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞的浸润，可模拟手术所致的局部和全身炎症反应过程。
首先研究者验证了海绵皮下植入确实可以诱发局部中性粒细胞、巨噬细胞及成纤维细胞在海绵周围局部浸润。
模型验证成功后，研究者开始研究海绵皮下植入对D2A1-GFP乳腺癌细胞增殖的影响。研究者首先要解决的问题是：伤口修复过程（皮下海绵植入模型）是否对局部的肿瘤细胞增殖发挥作用。共设立三组动物：第一组为对照组（无伤口）皮下直接注射D2A1-GFP乳腺癌细胞；第二组伤口修复造模后在伤口周围皮下注射D2A1-GFP乳腺癌细胞；第二组伤口修复造模后在伤口内注射D2A1-GFP乳腺癌细胞。
研究结果
结果显示：存在伤口修复模型的两组，D2A1-GFP乳腺癌细胞成瘤率明显上升，且瘤体大小也较对照组显著升高。
在完成伤口修复对局部肿瘤生长的影响后，研究者紧接着将关注点移到本文的重点关注部分，即手术是否引起术后转移。研究者将D2A1-GFP乳腺癌细胞种植在远离伤口处（或乳腺腺体原位种植）。结果显示，伤口修复过程能引起远处肿瘤细胞的增殖（瘤体大小和成瘤率在存在伤口修复的模型中均较无伤口组显著增加）。
为验证上述过程是否同小鼠的免疫相关，研究在NOD/SCID小鼠（免疫重度缺陷）中重复上述实验，结果提示在免疫缺陷的裸鼠中，伤口修复则无法促进肿瘤细胞的增殖。
此外,研究还通过调整手术伤口造模与肿瘤细胞种植的时间节点，以及直接行皮肤切口，或不同部位注射等因素，从不同角度证明手术后的伤口修复确实能促进远隔部位肿瘤细胞的增殖。
非常有意思的是——Robert Weinberg教授的实验室果然非常豪气，居然一口气在273只小鼠上重复了上述实验，也就有了基础研究领域非常罕见的meta分析！
Meta分析的结果同样证实了手术所致的伤口修复过程能引起远处具有免疫原性的肿瘤细胞（D2A1-GFP）的增殖。
那么能否抑制这种由手术所致伤口修复所引起的系统性炎症反应导致的远处免疫原性的肿瘤细胞增殖呢？要解决这个问题，我们首先要研究其中的机制。
研究者检测了伤口修复组和对照组血液中的炎症细胞，结果显示中性粒细胞和炎症性单核细胞在手术后第7天均显著升高。此外，研究还发现IL-6、G-CSF、CCL2等细胞趋化因子在伤口修复组亦显著上升，其中G-CSF、CCL2是已经被证实能招募中性粒细胞和炎症性单核细胞进入循环池的细胞趋化因子。上述结果提示手术后伤口修复可诱发全身性炎症反应。
那么何种免疫细胞在手术所致的伤口修复过程所致的全身炎症反应中发挥作用呢？
研究者在伤口修复模型中发现：CD8+T细胞的百分比与肿瘤大小成反比，CD8+T细胞百分比与D2A1-GFP乳腺癌细胞数呈反比，CD4+T细胞百分比与D2A1-GFP乳腺癌细胞数同样呈反比，CD11b+T细胞与CD8+T细胞的百分比呈反比。
在上述各种反比关系中，研究者进一步探索CD11b+T细胞与D2A1-GFP乳腺癌细胞数呈正比，同时CD11b+ T细胞/CD8+T细胞比值与D2A1-GFP乳腺癌细胞数呈正比。再次证实了D2A1-GFP乳腺癌细胞的增殖受CD8+T细胞严密监控。
前述研究已经发现伤口造模组中中性粒细胞和巨噬细胞显著升高，那么抑制这两种细胞后，能否能抑制肿瘤呢？ 研究者通过Anti-Ly6G抗体系统性敲除伤口造模小鼠内的中性粒细胞后发现肿瘤生长并未收到抑制。通过CRISPR-Cas9技术敲低CCL2后肿瘤生长明显收到抑制，而CCL2具有促进单核细胞向巨噬细胞转变的功能。至此研究者找到了巨噬细胞在手术所致伤口修复促进肿瘤增殖中具有重要作用的有力证据。
说到巨噬细胞，不得不提2018年初分享的另外一篇关于巨噬细胞介导乳腺癌发生早期细胞播散和转移发生的文章。可见巨噬细胞在乳腺癌的发生发展中的各个阶段均具有极为重要的作用。
那么为什么巨噬细胞会具有这种功能呢？ 研究者通过流式细胞技术检测发现巨噬细胞和D2A1-GFP乳腺癌细胞表面均高表达PD-L1。PD-L1正是目前热的发烫、红的发紫的肿瘤免疫治疗的明星分子。PD-L1与PD1结合能抑制T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。目前很多肿瘤免疫治疗正是使用相应的PD-L1或PD1抗体以阻断这种抑制机制，重新激活人体T细胞对肿瘤的杀伤。
根据上述结果，研究者对小鼠进行抗PD1治疗，结果显示：不管是无手术伤口修复的对照内，还是有手术伤口修复组内，抗PD1治疗能有效抑制肿瘤的增殖。
此结果证明：手术伤口修复所致的全身性炎症反应诱发巨噬细胞升高，而后者能通过PD-L1的表达抑制CD8+ T细胞对肿瘤细胞的监视，破坏了免疫平衡状态，导致原本处于“休眠状态”的远处肿瘤细胞增殖。
那么有没有什么方法可以解决呢？
研究者发现通过使用一种抗炎药物（美洛昔康Meloxicam）能有效抑制手术伤口修复所致的肿瘤增殖。
研究者进一步回顾相关临床研究发现，已有回顾性研究证实围手术期使用抗炎止痛药能降低乳腺癌术后早期转移，并且前瞻性的临床研究也正在开展。
周济春博士点评
Robert Weinberg教授通过这一设计巧妙的研究，很好的在基础研究层面证实了手术所致的伤口修复过程所引起的系统性炎症反应能促进原本受免疫严密监控的肿瘤细胞的增殖。从某种程度上部分还原了临床乳腺癌术后早期转移复发的现象，即手术可能激活休眠状态乳腺癌细胞的复苏和增殖。
诚如Robert Weinberg教授在文末中所言，他们的研究并不改变目前临床治疗策略（手术指征明确，还是应该手术治疗）。只是给临床医生某些启示，如提醒临床医生思考围手术期抗炎策略可能可进一步改变乳腺癌患者的预后。
那么“神药”二甲双胍和阿司匹林的围手术期特定时间节点使用对处于休眠状态的肿瘤细胞又有何种影响呢？
匹配良好的乳腺癌保乳和改良、前哨和腋清的人群研究又会给我们什么样的结果呢？这些都值得我们进一步思考和探索。