老朋友的新篇章：二甲双胍再战抗肿瘤免疫

概述

二甲双胍是1994年FDA批准的治疗2型糖尿病（T2D）的一线口服药物。在过去几十年的临床经验中，它已被广泛用于T2D患者，并被认为是一种安全且耐受性良好的药物。有趣的是，一些针对T2D患者的病例对照研究显示各种癌症类型的发病率降低，这提示二甲双胍可能拥有降糖之外的抗肿瘤作用。事实上，相当多的研究报告了二甲双胍可以通过不同的途径对不同类型的癌症具有抗增殖作用。

最近在免疫肿瘤学领域的研究报告了二甲双胍与免疫相关的全身效应。有趣的是，在相同的条件下，二甲双胍在免疫正常小鼠模型中的抗肿瘤作用远高于免疫缺陷小鼠模型，这意味着在生理和临床条件下，二甲双胍的作用主要是通过抗肿瘤免疫介导的。二甲双胍的免疫调节活性在七十年前就被报道有抗病毒和抗疟疾的作用。这得到了最近几项发现的支持，包括二甲双胍增加了CD8+T细胞活性。

由于T细胞是抗肿瘤免疫的主要效应器，T细胞活性一直是大多数FDA批准的肿瘤免疫疗法的最终目标。然而，由于肿瘤的免疫微环境（TME）能有效地抑制TIL活性，目前的免疫疗法在大多数实体瘤中的疗效有限。在以往对糖尿病、心血管疾病和自身免疫性疾病的研究中，二甲双胍通过影响炎症、缺氧、血管生成和T细胞活性，这些TME的主要成分，来改善每种疾病的预后。这些结果表明二甲双胍的抗肿瘤作用可能是通过这些TME成分来实现的。因此二甲双胍作为一种基于T细胞的肿瘤免疫治疗的潜在佐剂值得进一步的研究。

肿瘤发生与抗肿瘤免疫

在肿瘤的发展过程中，癌细胞和我们的免疫系统进行了一场激烈的斗争，这场斗争主要发生在三个阶段：起始、促进和进展。在起始阶段，由多种致癌物质引起的基因组突变，可以激活癌基因并抑制肿瘤抑制基因。初始细胞通过关键突变的积累而转化。当启动的细胞暴露于生长因子时，细胞在促进阶段积累了更多的突变，并具有高增殖性。然而，大多数转化细胞都被固有免疫和适应性免疫清除。在固有免疫中，具有非经典主要组织相容性复合体（MHC）I异常表达的癌细胞被自然杀伤（NK）细胞识别，活化的NK细胞通过分泌细胞毒性穿孔素和颗粒酶溶解癌细胞。M1巨噬细胞和树突状细胞（DC）被癌细胞分泌的炎性趋化因子募集。这些抗原提呈细胞（APCs）不仅通过吞噬作用吞噬癌细胞，而且通过向引流淋巴结中的T细胞递呈肿瘤抗原来支持适应性免疫。最后，激活的CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能特异性地清除癌细胞。

少数癌细胞经过反复增殖和消除，导致它们长期存活而不形成肿瘤，但经过长期严格筛选的癌细胞获得突变以逃避免疫监视。大多数存活的癌细胞下调经典MHC I水平和相关的抗原处理和呈递机制（APM），从而阻止CD8+CTL的识别。另一方面，癌细胞增加非经典MHC I水平，以避免NK细胞的威胁。在经过所有这些之后，逃避免疫监视的癌细胞在进展阶段形成肿瘤。

随着肿瘤的生长，大多数实体瘤建立了由细胞和非细胞成分组成的TME，包括免疫细胞、成纤维细胞、血管、炎症信号、缺氧和缺糖。肿瘤的恶性程度与肿瘤细胞与TME的相互作用密切相关。特别是，促肿瘤的TME，如缺氧、慢性炎症和免疫抑制剂，例如，抑制性免疫检查点、M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、调节性T细胞（T regs）和髓源性抑制细胞（MDSCs），抑制T细胞监测并促进转移。

二甲双胍的抗肿瘤免疫作用

TME各成分之间存在着非常复杂的联系，TME抗肿瘤免疫功能的失调是由于不同阶段多种免疫抑制作用的累积所致。因此，针对多靶点的综合治疗方法可以有效地提高肿瘤免疫治疗的疗效。以下是二甲双胍靶向的TME成分。

二甲双胍在慢性炎症中的作用

炎症就像癌症发展中的一把双刃剑。作为固有免疫的一个组成部分，炎症在清除转化细胞并随后为适应性免疫呈递癌症抗原方面起着重要作用。然而，已知慢性炎症会增加各种癌症的发病率和恶性程度。各种炎性细胞（例如巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞）的激活引起细胞因子风暴，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和ROS。慢性暴露于这些炎症信号会增加TME中M2样TAM的数量，不仅通过激活血管生成和上皮间充质转换（EMT）诱导转移，还抑制T细胞免疫。此外，慢性炎症可将骨髓髓样前体细胞分化为MDSCs，MDSCs是一种主要类型的免疫抑制细胞，通过表达抑制检查点和干扰T细胞转移到肿瘤中来消耗T细胞。

最近，二甲双胍在几种不同的疾病模型中都被证实具有抗炎作用。二甲双胍可减轻多发性硬化症（一种中枢神经系统自身免疫性疾病）的诱导作用。在这项研究中，二甲双胍通过下调趋化因子和促炎性细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17）的水平来抑制单核细胞向中枢神经系统的浸润。对T2D患者的对照病例研究表明，二甲双胍可减少心血管并发症，相关机制研究表明，二甲双胍通过AMPK途径使NF-kB信号失活，从而降低炎症细胞因子水平，包括TNF-α和IL-6。此外，二甲双胍还通过抑制线粒体复合物I抑制LPS激活的巨噬细胞产生ROS和IL-1β。总的来说，二甲双胍具有减轻肿瘤前炎症的有益作用，有望预防肿瘤恶性肿瘤和TME中的T细胞衰竭。

二甲双胍对肿瘤内缺氧的影响

缺氧是一种重要的恶性TME成分。随着肿瘤的生长，癌细胞迅速消耗氧气。导致肿瘤缺氧。癌细胞显著地改变了它们的基因图谱，以克服恶劣的条件并保持增殖。缺氧诱导因子（HIF-1）是激活参与葡萄糖吸收、糖酵解和血管生成相关基因的主要转录因子。缺氧和HIF信号也通过增加EMT相关基因的表达和通过血管生成增加癌细胞的扩散来诱导转移。此外，缺氧和HIF信号有助于癌细胞逃避免疫监视，缺氧可通过抑制DC激活T细胞的刺激能力来干扰适应性免疫。缺氧还通过降低增殖和活力来限制TIL的数量。缺氧持续增加PD-L1的水平，PD-L1是一种主要的抑制性免疫检查点分子，可诱导TME的T细胞衰竭。

最近的一项研究报告了二甲双胍的抗缺氧作用。在这项研究中，二甲双胍治疗减少了缺氧的阳性区域，同时HIF-1α和促血管生成因子水平降低。二甲双胍通过缺氧抑制肝细胞癌和口腔鳞状细胞癌中HIF-1α的积聚。重要的是，Scharping等人报道二甲双胍可通过降低氧耗来缓解肿瘤内缺氧，从而提高TME的T细胞免疫功能。因此，二甲双胍与靶向PD-1的ICB具有显著的协同抗肿瘤作用。这些证据表明，二甲双胍治疗可以通过减轻肿瘤内缺氧而提高T细胞免疫功能。

二甲双胍对PD-L1表达的影响

程序性死亡配体1（PD-L1）是一种主要的免疫检查点分子，对T细胞活性有负性调节作用。在各种癌症类型中，如肾细胞癌（RCC）、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌（NSCLC）、甲状腺乳头状癌和睾丸癌，PD-L1的高水平表达与预后不良有关。PD-L1与PD-1受体的结合抑制T细胞受体（TCR）信号级联反应，并抑制CTL的活性。因此，有人积极尝试通过阻断PD-L1/PD-1信号来恢复CTL活性。

最近，研究报道了二甲双胍激活的AMPK直接在PD-L1的195丝氨酸处磷酸化，导致PD-L1的异常糖基化。最终，异常的PD-L1通过内质网相关蛋白降解（ERAD）途径降解，恢复CD8+CTL活性。此外，二甲双胍通过降低IFN-γ治疗增加的膜结合PD-L1水平来改善CD8+T细胞的细胞毒性；聚ADP核糖聚合酶抑制剂（PARPi）耐药细胞上调PD-L1表达，二甲双胍处理后逆转PD-L1水平，使PARPi耐药细胞对CTL敏感。这些研究都表明二甲双胍可以通过降低TME中PD-L1水平来提高T细胞免疫功能。

二甲双胍对T细胞代谢重编程的影响

在适应性免疫中，受引流淋巴结吞噬性APCs诱导的效应CD8+CTL可以特异性识别和杀伤肿瘤细胞。然而，它们的衰竭会导致失能和细胞凋亡。癌细胞依赖于低效的有氧糖酵解作为ATP的主要来源，而不是氧化磷酸化，并通过积极吸收葡萄糖来满足需要。一种被称为“沃堡效应”的不寻常的代谢特性对癌细胞在缺氧条件下的存活具有优势。有趣的是，效应CTL的代谢在与肿瘤中的癌症抗原结合后转化为有氧糖酵解。这种代谢相似性鼓励癌细胞和CTL之间的糖摄取竞争，导致效应剂CD8+CTL的代谢衰竭。因此，衰竭T细胞的代谢重编程可以作为提高抗肿瘤免疫的治疗靶点。

由于二甲双胍的下游因子AMPK和mTOR是能量敏感和线粒体功能的主要调节因子，二甲双胍可能对衰竭T细胞的代谢重编程起作用。事实上，二甲双胍治疗已经被证明可以增加肿瘤中CD8+CTL的数量并防止其衰竭。据报道，AMPK在葡萄糖缺乏时通过激活氧化代谢来维持CTL的一致活性，在体外激活和体内肿瘤发展过程中，对T细胞中的AMPKα1进行基因敲除可导致CD8+CTL凋亡，并在免疫能力强的小鼠模型中促进肿瘤生长。

大多数完成任务的CD8+T细胞通过凋亡的方式被移除，其中一些细胞分化成CD8+记忆T细胞，它们对同一个敌人反应更快、更有效，防止复发。这种向CD8+记忆性T细胞的转变也需要代谢重编程。有趣的是，Elikawa等人表明二甲双胍不仅能增强CD8+CTL的多功能性，而且能提高长期记忆免疫功能。在本研究中，二甲双胍治疗可提高效应记忆T细胞/中枢记忆T细胞（TEM/TCM）比值。总的来说，二甲双胍可能通过AMPK/mTOR途径的代谢重编程来提高CTL的抗肿瘤效能和体内持久性。

二甲双胍对肠道菌群的影响

肠道微生物群异常在许多与免疫紊乱相关的疾病中出现，如炎症性肠病、类风湿性关节炎、心肌代谢疾病、中枢神经系统自身免疫性疾病和癌症。通过这种微生物免疫系统的直接调节可以改善我们的免疫系统。有研究表明肠道菌群可能是二甲双胍的重要介质，对肿瘤免疫有积极影响。

最近，三个不同的小组在相似的时间报告说，在ICB应答者和非应答者之间观察到了不同的肠道微生物群特征，肠道菌群对ICB的治疗效果有很大影响，粪便微生物移植（FMT）模型显示IBC应答者移植的ICB疗效远高于无应答者，ICB应答者的FMT显著提高了T细胞免疫功能。此外，对ICB免疫治疗有益的微生物被鉴定为（1）prausnitzii粪杆菌，（2）长双歧杆菌，（3）粘液阿克曼菌。

Cuesta Zuluaga等人证明了T2D、二甲双胍和肠道菌群的相关性。有趣的是，二甲双胍改变了T2D患者的肠道菌群，尤其是增加了嗜粘多菌和几种双歧杆菌。如前所述，粘粘杆菌和双歧杆菌是被鉴定为有益于ICB免疫治疗的微生物种类。此外，已知嗜粘杆菌和双歧杆菌能产生短链脂肪酸（SCFA），如醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐，它们具有免疫调节和抗炎作用。这些证据有力地支持二甲双胍可以通过肠道菌群系统地影响抗肿瘤免疫。然而，二甲双胍如何改变肠道菌群以利于抗肿瘤免疫，以及二甲双胍增加细菌种类与抗肿瘤免疫之间的联系在很大程度上还不清楚。

小结

目前的肿瘤免疫治疗大多以TIL为靶点，通过维持TIL在TME中的活性来发挥作用。为了确保其有效性，必须充分实现抗肿瘤免疫过程，包括APCs浸润、癌抗原呈递、T细胞启动和TIL活性维持。事实上，达到这些先决条件的“热”肿瘤对癌症免疫治疗反应良好，但不满足这些先决条件的“冷”肿瘤对免疫治疗的反应较差。如果冷肿瘤能转化为热肿瘤，将大大提高目前肿瘤免疫治疗的疗效，扩大受益人群。

在这种有利的转化过程中，问题在于冷肿瘤中的免疫抑制的TME在抗肿瘤免疫的不同阶段抑制多个靶点。因此，很难期望通过单因素或路径调整方法进行有效的转换。虽然抑制剂鸡尾酒的选择可以考虑针对多种免疫抑制因子，但它可能会导致过度的副作用，如累积毒性。为了支持冷肿瘤的转化，重新定位先前耐受良好、具有多重免疫调节作用的药物将是一种更有效、更安全的方法。

二甲双胍的安全性和耐受性已经被几十年的临床经验所证明。此外，该药物对抗肿瘤免疫有多种有益作用，例如具有抗炎和抗缺氧作用，增加T细胞活性，并对肠道微生物群产生有利作用。此外，对照病例研究表明，二甲双胍可降低各类癌症的发生率，并通过多种动物模型观察到二甲双胍对抗肿瘤免疫的积极作用。这些发现有力地表明，二甲双胍有很高的潜力成为一种佐剂，通过支持冷肿瘤的稳定转化，全面压倒免疫抑制性TMEs。已经有二甲双胍和ICB联合治疗的临床研究在开展中，期待老朋友的重新评价，在新的战场给我们带来惊喜。

参考文献：

1.A new aspect of an old friend: the beneficial effect of metformin on anti-tumor immunity. BMB Rep. 2020 Nov;53(10):512-520.