协和论文拾粹｜本期介绍北京协和医院基本外科赵玉沛院士团队Q1区文章
协和论文拾粹--25
本期介绍北京协和医院基本外科赵玉沛院士团队于 2018年4月发表于Web of Science数据库Q1区杂志“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research ”上的文章“MiR-10a-5p targets TFAP2C to promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma ”
影响因子“ 5.189 ”
MiR-10a-5p通过调控TFAP2C促进胰腺癌吉西他滨化疗耐药
熊光冰，黄华，冯梦宇，杨刚，郑苏丽，由磊，郑连芳，胡亚，张太平，赵玉沛
背景及研究目的：
微小RNA（miRNA）可通过调控靶基因表达在胰腺导管腺癌中发挥促癌作用并参与化疗耐药调控。既往研究表明，miR-10a-5p在胰腺导管腺癌中呈高表达，同时可发挥癌基因作用促进胰腺癌细胞转移。然而其在胰腺癌化疗耐药中的作用尚不明确。
方法：
采用细胞培养、转染、CCK8、RT-PCR、免疫印迹等方法检测miR-10a-5p对胰腺癌生物学行为的影响；采用原位杂交和免疫组化方法分别检测miR-10a-5p和转录因子激活蛋白γ（TFAP2C）在胰腺癌组织中的表达水平，并评估其临床意义。
主要结果：
研究首先证实miR-10a-5p在吉西他滨耐药胰腺癌细胞株中表达水平较亲本株明显升高；体内和体外实验结果表明miR-10a-5p可促进胰腺癌细胞吉西他滨耐药，并可促进胰腺癌细胞侵袭和迁移。双萤光素酶报告基因实验证实TFAP2C可与miR-10a-5p直接结合；进一步研究表明，TFAP2C可降低胰腺癌细胞侵袭和迁移能力。补救实验表明，TFAP2C可逆转miR-10a-5p诱导的胰腺癌细胞吉西他滨化疗耐受。最后，生存分析结果表明miR-10a-5p高表达和TFAP2C低表达均是胰腺癌不良预后的独立危险因素。
结论：
miR-10a-5p/TFAP2C或许能够成为胰腺癌潜在的治疗靶点及预后标志物。
图1 miR-10a-5p促进胰腺癌细胞吉西他滨化疗耐药
a RT-PCR结果证实miR-10a-5p在胰腺癌吉西他滨耐药株ASPC-1/GR中表达明显上调；
b ASPC-1细胞中miR-10a-5p瞬时和稳定转染效率验证；
c miR-10a-5p mimics 可以显著增加ASPC-1细胞对吉西他滨的耐受性；
d miR-10a-5p inhibitor 可以显著降低ASPC-1细胞对吉西他滨的耐受性；
e 六株胰腺癌细胞系中miR-10a-5p的表达水平；
f T3M4和Su86.86细胞系中miR-10a-5p转染效率验证；
g miR-10a-5p mimics 可以显著增加T3M4细胞对吉西他滨的耐受性；
h miR-10a-5p inhibitor 可以显著降低Su86.86细胞对吉西他滨的耐受性；
i 裸鼠移植瘤接受吉西他滨治疗4周后两组肿瘤对比照片；
j 吉西他滨治疗后裸鼠体内肿瘤生长曲线；
k 吉西他滨治疗4周后，miR-10a-5p过表达组的肿瘤重量重于对照组。
所有数据均以平均值±标准差表示，统计学方法采用t检验，以P < 0.05表示有统计学差异。
图2 miR-10a-5p靶向调控TFAP2C促进胰腺癌细胞吉西他滨化疗耐药
a、b 双萤光素酶报告基因实验证实TFAP2C是miR-10a-5p的直接靶点；
c miR-10a-5p 对ASPC-1细胞的TFAP2C mRNA水平没有影响；
d ASPC-1细胞中过表达miR-10a-5p可以下调TFAP2C蛋白水平；
e miR-10a-5p对T3M4和Su86.86细胞的TFAP2C mRNA水平没有影响；
f T3M4和Su86.86细胞中过表达miR-10a-5p可以下调TFAP2C蛋白水平；
g miR-10a-5p稳定过表达的ASPC-1细胞中上调TFAP2C可以显著增加吉西他滨化疗敏感性；
h miR-10a-5p mimics对照稳定过表达的ASPC-1细胞中上调TFAP2C可以显著增加吉西他滨化疗敏感性；
i miR-10a-5p稳定过表达的ASPC-1细胞中上调TFAP2C可以显著增加吉西他滨诱导的细胞凋亡；
j miR-10a-5p mimics对照稳定过表达的ASPC-1细胞中上调TFAP2C可以显著增加吉西他滨诱导的细胞凋亡。
所有数据均以平均值±标准差表示，统计学方法采用t检验，以P < 0.05表示有统计学差异。
图3 miR-10a-5p高表达和胰腺癌不良预后有关
a 采用原位杂交检测90例胰腺癌组织和配对癌旁组织的miR-10a-5p表达水平，左图代表阴性对照；
b 采用卡方检验分析癌组织和癌旁组织中miR-10a-5p表达水平；
c 生存分析结果表明，胰腺癌组织中miR-10a-5p高表达与胰腺癌不良预后相关。
评论
胰腺癌恶性程度高，预后差，5年生存率不到8%。化疗耐药仍是限制其预后的重要因素之一。近年来关于miRNA在恶性肿瘤化疗耐药中的研究取得了长足进展，然而并没有大幅延长胰腺癌患者生存时间。因此，寻找miRNA的下游靶点并阐释其作用机制对于改善胰腺癌患者预后具有重要的意义。
本文采用miRNA高通量芯片技术分析筛选出吉西他滨耐药胰腺癌细胞株中表达上调的miRNAs——miR-10a-5p，采用体内实验、体外实验和临床标本验证三个层面的研究，证实了miR-10a-5p在胰腺癌中的促癌以及诱导化疗耐受作用。通过生物信息学数据库预测TFAP2C为miR-10a-5p的下游靶点，随后采用双萤光素酶报告基因实验证实了两者结合，补救实验结果表明过表达TFAP2C可以逆转miR-10a-5p诱导的胰腺癌吉西他滨化疗耐药。生存分析证实miR-10a-5p高表达和TFAP2C低表达均为胰腺癌患者预后不良的独立危险因素。通过本研究证实了miR-10a-5p/TFAP2C或许能够成为胰腺癌潜在的治疗靶点，开发针对该靶点的治疗或许对于改善胰腺癌吉西他滨化疗耐药具有重要的意义。
本研究不足之处在于胰腺癌组织中TFAP2C和miR-10a-5p表达的关联分析未得到预期的相关结论，可能和样本数量偏少有关，也可能与胰腺癌中复杂的调控网络有关。后续的研究中可以进一步扩大胰腺癌组织样本量验证两者的相关性，此外，可以开发针对TFAP2C的药物在裸鼠体内证实其是否可逆转miR-10a-5p诱导的化疗耐受，为转化应用到临床提供依据。
通讯作者简介
张太平
北京协和医院基本外科副主任，教授，博士生导师，主要研究方向：胰腺癌的早期诊断与化疗耐药。
通讯作者简介
赵玉沛
中国科学院院士 北京协和医院院长，教授，博士生导师。主要研究方向：普通外科学，胰腺疾病的基础与临床研究。
熊光冰
2017年毕业于北京协和医学院，获临床医学外科学博士学位。现为华中科技大学附属同济医学院同济医院外科住院医师，主要研究方向：胰腺癌的临床与基础研究。
第一作者简介
黄华
2015年毕业于北京协和医学院临床医学八年制，获临床医学博士学位。现为北京协和医院外科住院医师。主要研究方向：胰腺癌的早期诊断与治疗。
第一作者简介
冯梦宇
北京协和医院基本外科2016级临床型博士研究生，主要研究方向：胰腺癌的早期诊断与化疗耐药。
第一作者简介
杨刚
北京协和医院临床医学博士在读，主要研究方向：胰腺癌的早期诊断与治疗
本期栏目主持人
韩显林
北京协和医院基本外科主治医师，毕业于北京协和医学院八年制，获临床医学博士。研究方向：胰腺疾病的诊治及基础研究。
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