基于粪便代谢组学的黄芩酒炙改善急性肺损伤的作用机制研究

摘 要：目的 基于粪便代谢组学技术考察生、酒黄芩对急性肺损伤（acutelung injury，ALI）小鼠内源性代谢物的影响，并探讨黄芩酒炙“行上焦、清湿热”的作用机制。方法 小鼠口咽吸入脂多糖建立ALI模型，通过脏器指数、肺组织病理及支气管肺泡灌洗液中细胞因子水平，评价生、酒黄芩的疗效差异；采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF- MS）法检测内源性代谢物，运用主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partialleast squares discriminant analysis，OPLS-DA）等方法寻找差异性代谢物及代谢通路。结果 与对照组比较，模型组小鼠胸腺指数、脾脏指数显著降低（P＜0.01），肺干湿质量比显著增加（P＜0.01）；支气管肺泡灌洗液中白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）水平显著升高（P＜0.01），IL-10水平显著降低（P＜0.01）。酒黄芩组的免疫调节及炎性反应抑制作用均显著优于生黄芩组（P＜0.01）。模型组小鼠粪便中氨基酸、脂质类代谢均发生明显改变，生黄芩通过影响D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢通路、鞘脂类代谢通路抑制炎性反应，酒黄芩通过影响苯丙氨酸代谢通路抑制炎性反应。结论 生、酒黄芩能够通过调节不同代谢通路抑制ALI小鼠肺部炎性反应，为阐明黄芩生熟异用的作用机制差异提供思路。

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效[1]。《中国药典》2020年版收载黄芩和酒黄芩2个品种：生黄芩清热泻火，解毒力强，常须炮制后使用；酒黄芩可借酒升腾之力，用于治疗上焦肺热及四肢肌表之湿热[2]。本课题组前期对黄芩炮制前后的化学成分进行分析，发现黄芩酒炙后，黄酮苷类成分含量下降，黄酮苷元含量上升，苷类成分与苷元的比例变化趋势明显，可作为区分黄芩炮制前后的化学标志物[3-6]，表明酒炙后黄芩药材发生化学成分等内在变化，影响药物的性质及作用方向。目前针对黄芩酒炙对内源性成分、代谢通路等调控作用的研究较少，开展关于黄芩酒炙升提清肺热的机制研究对阐述酒炙内涵具有重要意义。

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是由多种肺内（肺炎、感染等）或肺外致病因素导致的急性弥漫性炎性肺损伤，进而引起急性呼吸衰竭的临床综合征[7-8]。全球急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的病死率高达40%以上，为威胁人类健康的重要疾病。本研究对生、酒黄芩治疗脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的ALI小鼠的药效作用差异及其粪便中差异性内源性代谢物进行研究，阐明生、酒黄芩抑制肺部炎性反应潜在的生物标志物及相关代谢通路，为酒炙黄芩“行上焦、清湿热”的作用机制研究提供依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量（20±2）g，购自山东斯科贝斯生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK（鲁）20160001。动物于相对湿度（50±10）%、温度（20±2）℃、自然节律光照的SPF级动物房适应性饲养1周，自由进食饮水。动物实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号JZSYDWLL-20200611）。

1.2 药品与试剂

生黄芩饮片（批号18062101）购自天津盛实百草药业有限公司，经江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室杨明教授鉴定为唇形科植物黄芩S. baicalensis Georgi的干燥根，酒黄芩饮片由生黄芩按《中国药典》标准规范炮制而成；LPS（批号MB5198）购自美国Sigma公司；地塞米松磷酸钠注射液（批号1901082）购自湖北天药药业有限公司；小鼠白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号2020-06R）购自江苏酶免实业有限公司；质谱级甲醇、乙腈购自上海罗恩公司；色谱级甲酸购自德国Merck公司。

1.3 仪器

Triple TOFTM5600型液相色谱-串联质谱仪（LC-MS，美国AB SCIEX公司）；Multiskan GO 1510型多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；BSA124型万分之一电子分析天平、BT25S型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；TGL-20MC型台式高速冷冻离心机（湖南湘鑫仪器仪表有限公司）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；V3S025型漩涡仪（德国IKA公司）；Medium-E400UF型实验室纯水系统（上海和泰仪器有限公司）。

2 方法

2.1 生、酒黄芩提取物的制备

称取生黄芩50 g，分别加入10、8倍量的水回流提取2 h，经纱布滤过，合并2次滤液，旋转蒸发浓缩至50 mL，得到含生药量1 g/mL的生黄芩提取物。酒黄芩按同法制得酒黄芩提取物。

2.2 分组、给药与造模

C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、地塞米松（5 mg/kg）组、生黄芩（15 g/kg）组和酒黄芩（15 g/kg）组，每组8只。生黄芩组和酒黄芩组ig相应药物，对照组和模型组ig等体积蒸馏水，1次/d，连续7 d；地塞米松组第1～6天ig等体积蒸馏水，第7天ip地塞米松磷酸钠注射液。末次给药30 min后，小鼠吸入异氟烷麻醉，模型组和各给药组小鼠口咽后壁滴入50 μLLPS溶液（1 mg/mL），对照组滴入生理盐水，迅速捏住小鼠鼻孔，维持30 s，等待出现轻微气管罗音，即造模成功。造模16 h后，于无菌条件下手持小鼠，挤压小鼠肛门刺激排便，用无菌冻存管收集，于液氮中保存。

2.3 生、酒黄芩对ALI小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平的影响

小鼠吸入CO2安乐死，行颈部手术暴露气管，在甲状腺位置做T型切口，用22 G静脉穿刺针做气管插管，以0.5 mL PBS溶液灌洗左肺3次，回抽灌洗液即得BALF，1500 r/min离心10 min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书测定BALF中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平。

2.4 生、酒黄芩对ALI小鼠肺干湿质量比和脏器指数的影响

取小鼠右肺下叶，称定质量，计算肺干湿质量比；取胸腺、脾脏，称定质量，计算小鼠脏器指数。

肺干湿质量比＝肺干质量/肺湿质量

脏器指数＝脏器质量/小鼠体质量

2.5 生、酒黄芩对ALI小鼠肺组织病理变化的影响

取小鼠右肺上叶浸泡于组织固定液中，室温放置24 h以上，进行苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下观察并拍照。

2.6 粪便代谢组学研究

2.6.1粪便样本处理称取各组小鼠粪便样本20 mg，加入120 μL甲醇，匀浆1 min，4 ℃、14 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL，4 ℃、14 000 r/min离心10 min，取上清液50 μL，进行超高效液相色谱-飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）分析。称取各粪便样本10 mg，按上述方法处理后作为质控样品。分析前连续进样3次确保仪器稳定性良好，分析过程中每进8针样品后进1针质控样品。

2.6.2色谱条件Phenomenex Kinetex C18色谱柱（100 mm×3 mm，2.6 μm），流动相为甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～4 min，5%～25% B；4～10 min，25%～45% B；10～22 min，45%～95% B；22～25 min，95%～5% B；体积流量为0.3 mL/min；柱温为40 ℃；进样体积为1 μL。

2.6.3 质谱条件离子化模式为电喷雾正离子模式和负离子模式；离子源电压为5500 V；离子源温度为550 ℃；去簇电压为100 V/−100 V；碰撞能量为35 eV/−35 eV，碰撞能量扩展为20 eV；雾化气体为N2；辅助气1为379.225 kPa，辅助气2为379.225 kPa，气帘气为241.325 kPa；一级质谱母离子扫描范围为m/z 50～1250；IDA设置响应值超过10 cp的峰优先进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为m/z 50～1250，开启动态背景扣除。

2.7 数据处理及分析

使用Markview 1.3.1软件对原始数据进行峰识别、对齐、滤噪、峰面积归一化等预处理，得到含有代谢物保留时间（tR）、质荷比、强度等信息的数据矩阵文件。将其导入SIMCA-P 14.0软件进行主成分分析（principal componentanalysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA），将变量投影重要性值（variable importance in projection，VIP）＞1.0和P＜0.05的变量视为差异变量。

利用HMDB（http://www.hmdb.ca/）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库（http://www.kegg.ca/）对差异变量的二级碎片离子进行鉴定，检索误差范围设置为0.1；使用MetaboAnalyst 5.0数据库（http://www.metaboanalyst.ca/）进行代谢通路分析，影响值＞0.1的代谢通路被认为是潜在的靶点路径。

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，采用单因素方差（One-way ANOVA）分析数据，多组间两两比较采用LSD-t检验。数据以表示，采用GraphPad Prism 8软件绘制统计图。

3 结果

3.1 生、酒黄芩对ALI小鼠BALF中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平的影响

如图1所示，与对照组比较，模型组小鼠BALF中IL-6、IL-8和TNF-α水平显著升高（P＜0.01），IL-10水平显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，生、酒黄芩组小鼠BALF中IL-6、IL-8和TNF-α水平显著降低（P＜0.01），IL-10水平显著升高（P＜0.01）；酒黄芩抑制ALI小鼠肺部炎性反应作用明显优于生黄芩（P＜0.01）。

3.2 生、酒黄芩对ALI小鼠肺干湿质量比和脏器指数的影响

胸腺和脾脏指数通常被用作评估宿主免疫能力。如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠胸腺和脾脏指数均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，酒黄芩组小鼠胸腺指数和脾脏指数均显著升高（P＜0.05、0.01），生黄芩组小鼠胸腺指数和脾脏指数呈升高趋势，地塞米松组小鼠胸腺指数和脾脏指数均显著降低（P＜0.01），表明地塞米松对机体免疫器官造成损伤[9]。肺水肿是ALI最主要的病理特征之一，与对照组比较，模型组小鼠肺干湿质量比显著升高（P＜0.01），肺水肿严重；与模型组比较，地塞米松组和酒黄芩组小鼠肺干湿质量比显著降低（P＜0.01），生黄芩组小鼠肺干湿质量比呈降低趋势，表明酒黄芩改善ALI小鼠脏器损伤的作用优于生黄芩。

3.3 生、酒黄芩对ALI小鼠肺组织病理变化的影响

如图3所示，对照组小鼠肺组织结构清晰，肺泡间隔及肺泡腔未见明显病理改变；模型组小鼠肺组织炎性细胞浸润明显，肺泡壁明显增厚和间质水肿，表明造模成功；各给药组肺组织病变程度降低，炎性细胞浸润和红细胞渗出、增生等情况均有所改善，其中酒黄芩组与对照组小鼠肺组织形态相似。

3.4 UPLC-QTOF-MS分析

正、负离子模式下，小鼠粪便总离子流图见图4。针对系统稳定性，随机选取质控样本中的12个分子离子峰，计算其tR和峰强度的RSD见表1，选取的12个分子离子峰tR的RSD为0.02%～0.15%，峰强度的RSD为3.14%～8.78%，表明质控样品中的离子具有良好的质量准确度，符合代谢组学分析要求。

3.5 多元统计分析

3.5.1PCA分析如图5所示，正、负离子模式下，各组样本之间存在一定的交叉，但对照组与模型组样本可较明显地分开，表明ALI小鼠粪便中的代谢物发生了明显的变化。

3.5.2 OPLS-DA分析采用有监督的OPLS-DA方法确定ALI小鼠造模前后及生、酒黄芩治疗后粪便中内源性差异代谢物，如图6所示，对照组和模型组样本区分明显，正离子模式：R2X=0.451，R2Y=0.994，Q2=0.869；负离子模式：R2X=0.766，R2Y=1.000，Q2=0.814，表明该模型具有较好的鲁棒性和预测能力。

3.6 ALI小鼠粪便差异代谢物分析

基于上述OPLS-DA模型，结合VIP＞1且P＜0.05的筛选条件及数据库匹配结果，最终在对照组与模型组小鼠粪便中鉴定出10个差异代谢物（表2）。与对照组比较，模型组小鼠粪便中L-蛋氨酸、孕酮、孕烯醇酮、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸和鞘氨醇水平显著升高，花生四烯酸、L-色氨酸、2′-脱氧尿苷和鸟苷水平显著降低。

影响ALI的代谢通路见图7，其中影响值＞0.1的代谢通路有9条，分别为：①苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸的生物合成；②D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢；③苯丙氨酸代谢；④花生四烯酸代谢；⑤丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；⑥鞘脂类代谢；⑦色氨酸代谢；⑧精氨酸的生物合成；⑨半胱氨酸和蛋氨酸代谢。由此可见，ALI小鼠体内正常的氨基酸代谢与脂质代谢水平发生紊乱。

3.7 生、酒黄芩对ALI小鼠粪便中差异代谢物的影响

如图8所示，与模型组比较，生黄芩组小鼠粪便代谢物花生四烯酸、2′-脱氧尿苷、鸟苷和L-色氨酸水平显著升高（P＜0.01），L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、孕酮、孕烯醇酮和鞘氨醇水平显著降低（P＜0.01）；酒黄芩组小鼠粪便代谢物花生四烯酸、鸟苷和L-色氨酸水平显著升高（P＜0.05、0.01），L-谷氨酸、L-P＜0.01）；生、酒黄芩组L-蛋氨酸水平无明显变化。

生、酒黄芩干预ALI的粪便差异代谢物见表3，代谢通路见图9，生、酒黄芩通过调节不同代谢途径发挥作用。各组间小鼠粪便差异代谢物韦恩图见图10，对照组与模型组、模型组与生黄芩组重叠的差异代谢物为鞘氨醇和L-谷氨酸；对照组与模型组、模型组与酒黄芩组重叠的差异代谢物为L-苯丙氨酸。生黄芩通过D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢通路以及鞘脂类代谢通路缓解ALI，而酒黄芩则调节苯丙氨酸代谢通路发挥疗效。

4 讨论

本研究通过小鼠口咽吸入LPS建立ALI模型，发现模型组小鼠出现免疫脏器损伤以及严重的肺组织损伤，且体内炎性因子水平失衡；酒黄芩的疗效优于生黄芩，与炮制理论一致。采用粪便代谢组学探究ALI潜在发病机制及黄芩酒炙干预ALI的内在机制，发现与对照组相比，ALI小鼠粪便中鉴定得到10个差异代谢物，主要包括氨基酸类、鞘氨醇及花生四烯酸等，主要涉及多种氨基酸的合成与代谢以及脂质代谢，这些潜在的代谢通路与文献报道一致[10]。生黄芩组中鉴定得到24个差异代谢物，酒黄芩组中鉴定得到21个差异代谢物，结合通路富集分析和组间差异代谢物的并集分析，发现生黄芩通过调节D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢通路和鞘脂类代谢通路发挥作用，而酒黄芩通过苯丙氨酸代谢通路发挥作用。

D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢通路中主要的代谢物L-谷氨酸和L-谷氨酰胺在抗氧化中发挥着重要作用[11-12]。活性氧自由基的过量产生可引起ALI[13]，因此当与抗氧化剂相关的代谢通路激活时，生成抗氧化剂清除过量氧自由基，恢复免疫系统的正常运行，维持机体氧化还原平衡。谷氨酸受体重要亚型之一的N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D- aspartate，NMDA）受体可因肺内谷氨酸含量升高而过度激活，使肺组织出现高通透性肺水肿[14]。本研究检测到模型组小鼠粪便中谷氨酸水平显著升高，表明LPS刺激后谷氨酸释放增多；在生黄芩干预下，谷氨酸水平显著下调，提示生黄芩可能通过阻断谷氨酸NMDA受体，发挥维持谷氨酸稳态与抗氧化应激的作用。近年来，大量研究表明苯丙氨酸在急性炎性疾病中发挥作用。体内高浓度苯丙氨酸可能增加ARDS的死亡率[15]。严重的肺部炎性反应导致苯丙氨酸-4-羟化酶及5,6,7,8-四氢生物蝶呤活性降低，苯丙氨酸累积，从而促进炎性反应[16]。本研究发现，给予酒黄芩后，ALI小鼠粪便中苯丙氨酸向正常水平回调，提示酒黄芩具有促进其转化并抑制炎性反应的作用。

综上，本研究通过ALI模型模拟上焦湿热症，考察生、酒黄芩干预ALI小鼠的药效差异以及内源性代谢物的差异影响，探讨黄芩酒炙“行上焦、清湿热”的作用机制，为解释中药炮制机制提供了一种新模式。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：孙豪杰，王雅琪，胡婷婷，万 娜，袁 恩，伍振峰，杨 明．基于粪便代谢组学的黄芩酒炙改善急性肺损伤的作用机制研究 [J]. 中草药, 2021, 52(18):5589-5598 .