速递丨靶向YAP介导的T细胞抑制或将改善BRAF突变型黑素瘤患者预后

导读

Hippo-YAP信号通路是肿瘤抑制的一个重要信号通路。新证据表明，YAP活化是黑素瘤BRAF抑制剂（BRAFi）的重要耐药机制，YAP参与抑制抗肿瘤免疫应答。然而，YAP活性对CTL免疫应答的潜在直接影响仍是一个未知领域。

近年来，通过单抗阻断免疫检查点受体PD-1的治疗方式使晚期黑色素瘤患者表现出了显著的临床反应。癌细胞表面PD-L1异常表达是许多肿瘤逃避抗肿瘤免疫应答的重要机制，PD-L1表达是免疫检查点抑制剂有效反应的预测性生物标志物。新研究表明，BRAFi耐药性黑素瘤细胞以PD-L1依赖方式，通过激活YAP，逃避CD8+T细胞免疫应答。

研究方法

首先，获取亲本和BRAFi耐药性SKMEL28和WM3248细胞。获取A375SM细胞并在补充10% FBS的DMEM中培养。获取MCF7，MDA-MB231和A172细胞并在补充10% FBS的DMEM中培养。获取HT29，KM12和A549细胞，并在补充10％ FBS的RPMI1640中培养。获取前，通过Sanger测序证实黑色素瘤细胞系BRAFV600E突变。连续处理2μMPLX4032两个月，产生BRAFi耐药性A375SM细胞。在含有2μMPLX4032的培养基中培养BRAFi耐药性细胞系。Sanger测序证实耐药细胞系具有BRAFV600E突变。常规检测细胞系支原体感染。所有细胞系都储存在液氮中，使用前培养不超过6个月。

应用逆转录病毒载体产生稳定表达YAP及其突变体的黑素瘤细胞和HEK293T细胞。制备克隆到pMSCV-puro载体中的FLAG-YAP野生型，FLAG-YAP-5SA和FLAG-YAP-5SA-S94A cDNA，进行逆转录病毒颗粒装配，转染和嘌呤霉素选择。根据制造商说明，应用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）获得的siRNA转染细胞。

主要结果

YAP激活可诱导BRAFi耐药性黑素瘤细胞上PD-L1表达

为研究YAP激活对免疫检查点通路的影响，研究人员首先检查了表达组成型活性YAP的黑色素瘤细胞的T细胞共抑制/共刺激配体（PD-L2，B7-1，B7-2，半乳糖凝集素9和CD155）。研究人员建立了具有FLAG标记的YAP-5SA载体的BRAFV600E突变型黑素瘤细胞系（SKMEL28, WM3248和A375SM）。既往研究表明，通过Hippo通路激酶LATS1和LATS2阻止YAP抑制性磷酸化，5SA突变会引起YAP组成型核定位和转录激活。注意，相较于亲代细胞，表达YAP-5SA的黑色素瘤细胞系表现出更广泛的PD-L1和PD-L2表面表达。另外，YAP-5SA（而非野生型YAP）过表达增加了三种黑色素瘤细胞系中PD-L1 mRNA表达以及其表面蛋白质表达。这些结果表明，YAP激活诱导了黑素瘤细胞中的PD-L1表达。研究人员还观察到乳腺癌（MCF7，MDA-MB231），NSCLC（A549），结肠癌（HT29）和成胶质细胞瘤（A172）细胞中YAP-5SA诱导的PD-L1上调。然而，YAP-5SA表达并未显着增加KM12结肠癌细胞中的PD-L1水平，这表明YAP介导的PD-L1诱导依赖于细胞背景。

研究人员还检测了BRAFi（威罗菲尼）耐药性黑色素瘤细胞中的PD-L1 mRNA和蛋白质表达。相较于亲本细胞，BRAFi耐药性SKMEL28, WM3248和A375SM细胞更多地表达PD-L1 mRNA和细胞表面蛋白。RNAi介导的YAP及其旁系同源TAZ敲低抑制了BRAFi耐药性细胞中的PD-L1转录和细胞表面表达，这表明YAP/TAZ活性增强与PD-L1表达增加相关。微阵列数据（GSE68599）比较了亲本和BRAFi耐药性黑素瘤细胞以及YAP/TAZ耗竭的耐药细胞，结果证实免疫检查点配体中耐药细胞PD-L1上调以及YAP/TAZ敲低后PD-L1表达减少。总之，这些结果表明YAP活化上调了黑素瘤细胞上的PD-L1表达。

YAP上调PD-L1，但独立于EGFR, AKT, MAPK和IFNγ通路

我们知道，EGFR，AKT和MAPK致癌通路激活可以诱导癌细胞上PD-L1表达。为检测这些通路是否参与YAP介导的PD-L1表达，研究人员应用埃罗替尼（EGFR抑制剂），MK-2206（AKT抑制剂）或PD0325901（MEK抑制剂）处理表达YAP-5SA的黑素瘤细胞并检测PD-L1表达。结果表明，很大程度上，PD-L1表达升高不受抑制致癌信号传导通路的影响，这说明YAP介导的PD-L1表达不需要这些通路。在延长的T细胞免疫应答期间，IFN-γ暴露也诱导PD-L1表达，引发适应性免疫逃避，因此研究人员检测了YAP是否参与IFNγ介导的PD-L1上调。短期（48小时）和长期（7天）IFNγ处理不能促进YAP核定位。此外，YAP/TAZ消耗不影响IFNγ诱导的PD-L1。研究人员还检测了YAP激活对JAK / STAT通路（IFNγ信号传导的主要下游效应子）的影响。表达模拟物和表达YAP-5SA的黑素瘤细胞中均无磷酸化STAT1活性，但IFNγ处理的模拟A375SM细胞显示出高磷酸化STAT1。这些结果说明IFNγ通路和YAP独立调节PD-L1表达。

YAP与PD-L1增强子区域结合并促进PD-L1转录

YAP主要通过与TEAD家族转录因子相互作用来促进靶基因转录。在TEAD结合位点引入突变可以显著抑制PD-L1上调。此外，应用维替泊芬处理YAP-5SA表达细胞可减少PD-L1 mRNA和表面表达。因此，完整的YAP-TEAD相互作用是上调PD-L1转录（通过YAP活性）的必要因素。其次，研究人员通过回顾公开可用的ChIP-seq数据，在潜在的PD-L1基因增强子区域探究了YAP-TEAD结合位点。他们在PD-L1转录起始位点的13-kb上游发现了可能提供YAP-TEAD结合位点的一个TEAD4结合窄峰。为确认YAP与这个区域结合，研究人员进行了ChIP分析。他们检测到了YAP-5SA与13kb上游区域特异性结合活性。为验证通过该候选增强子区域，YAP驱动的PD-L1转录激活，研究人员将13kb上游序列（800bp片段）克隆到具有最小启动子的荧光素酶载体中。增强子序列驱动的萤光素酶活性在表达YAP-5SA的HEK293T细胞中显著高于模拟转染的HEK293T细胞。这些结果表明，与13kb上游增强子结合的YAP-TEAD直接诱导PD-L1转录。

BRAFi耐药性黑素瘤细胞逃避肿瘤抗原特异性CD8+T细胞免疫应答

YAP激活促进BRAFi耐药性和PD-L1表达，YAP是BRAFi耐药性和免疫逃逸过程之间的分子桥梁。因此，研究人员研究了BRAFi耐药性黑素瘤细胞中YAP活化对肿瘤抗原特异性CD8+T细胞效应子功能的影响，应用表达HLA-A2的A375SM细胞进行细胞毒性测定。YAP-5SA表达和BRAFi耐药性均不影响HLA-A2表达。研究人员建立了HLA-A2限制性Melan-A肽特异性CD8+T细胞系（来自HLA-A2+健康供体的外周血单核细胞）。所得的细胞培养物含有95.9％的Melan-A26-35特异性CD8+T细胞并表现出最低程度的PD-1表达。为模拟肿瘤微环境中的T细胞耗尽，研究人员应用携带YAP-5SA的Melan-A26-35肽脉冲PD-L1+A375SM黑素瘤细胞培养T细胞系。培养7天后，研究人员观察到T细胞上PD-1表达的强烈诱导。然后，他们检查了PD-1+Melan-A26-35特异性CD8+T细胞抗同源抗原脉冲亲本和BRAFi耐药性A375SM细胞的细胞毒性。CD8+T细胞成功杀死了亲代A375SM细胞，随着效应子/靶标比率的增加，细胞毒性成比例增加。BRAFi耐药性A375SM细胞表现出对CD8+T细胞细胞毒性的抵抗性，它可以通过阻断PD-1而恢复，但抗PD-1抗体不影响亲代细胞的杀伤力。他们还研究了与黑素瘤细胞共培养的T细胞的其他效应器功能。结果表明，与BRAFi耐药性黑素瘤细胞共培养的CD8+T细胞中，IFNγ，TNFα产生显著减少，CD107a表达显著降低。这证实了BRAFi耐药性黑素瘤细胞中T细胞耗竭。与细胞毒性恢复一致，抗PD-1抗体治疗恢复了T细胞效应功能。这些结果表明，BRAFi耐药性黑素瘤细胞通过PD-1依赖性CD8+T细胞耗竭诱导免疫逃逸。

YAP介导黑素瘤细胞中肿瘤抗原特异性CD8+T细胞免疫逃逸

研究人员通过测定抗模拟和表达YAP-5SA的A375SM细胞的细胞毒性，研究了YAP激活对PD-1+Melan-A26-35特异性CD8+T细胞免疫应答的影响。表达YAP-5SA的黑色素瘤细胞比模拟细胞更具耐药性，PD-1阻断逆转了表达YAP-5SA的A375SM细胞的T细胞细胞毒性。Melan-A26-35特异性CD8+T细胞与YAP-5SA-表达细胞共培养减少了IFNγ和TNFα的产生，使CD107a表达减少。PD-1阻断可以恢复IFNγ，TNFα和CD107a表达减少。因为YAP-5SA诱导PD-L2和PD-L1表达，研究人员探究了PD-L1和PD-L2是否有助于YAP介导的T细胞抑制。与抗PD-1类似，PD-L1阻断抗体恢复了T细胞的细胞毒性功能，IFNγ和TNFα产生以及CD107a表达。相反，PD-L2阻断抗体治疗并不影响CD8+T细胞抗YAP-5SA表达黑素瘤细胞的细胞毒性和细胞因子产生，这说明PD-L2上调不是YAP介导的T细胞抑制的必要条件。总之，这些结果表明，黑素瘤细胞中YAP活化可以促进细胞毒性T细胞PD-1/PD-L1依赖性逃避。

PD-1阻断使与表达YAP-5SA的黑素瘤细胞共培养的CD8+T细胞的细胞毒性功能不完全修复。一种可能是PD- /PD-L1相互作用可能不会被抗PD-1完全阻断；另一种可能是YAP可能引起独立于PD-L1的免疫逃避机制。与YAP-5SA-表达黑素瘤细胞共培养后，非耗竭PD-1阴性Melan-A26-35特异性CD8+T细胞的细胞毒性功能和细胞因子产生受抑制，该抑制不受PD-1阻断的影响。这表明，YAP可以以PD-L1依赖性和PD-L1独立的方式，促进黑色素瘤细胞的免疫逃避。

YAP激活与黑素瘤组织中更高的PD-L1表达相关

为验证YAP介导的PD-L1表达的临床意义，研究人员探究了人类黑素瘤肿瘤样品中YAP活性与PD-L1表达之间的关系。首先，他们分析了来自TCGA数据库的472个黑素瘤肿瘤的RNA-seq数据，根据基因组变异分析（GSVA）计算的YAP信号富集分数对肿瘤进行分层。结果表明，具有高YAP富集评分的肿瘤具有显著更高的PD-L1表达。另外，他们对来自65名黑素瘤患者肿瘤标本的YAP和PD-L1进行了免疫组织化学染色。如预期，相较于细胞质YAP染色（低YAP活性）的肿瘤，核或核浆YAP染色（高YAP活性）的肿瘤具有显著更高的PD-L1表达。他们还探讨了BRAFi耐药性黑素瘤既往发布数据中YAP和PD-L1之间的联系。Hugo等人全面分析了BRAFi / MEKi疗法（GSE65185）前后收集的配对黑素瘤样品。他们在某些耐药肿瘤中发现了YAP信号激活。PD-L1表达与预处理肿瘤中的IFNγ表达相关。然而，在获得耐药性后，这种相关性减弱，这表明IFNγ以外的因子在控制BRAFi / MEKi耐药性肿瘤中PD-L1表达中起关键作用。YAP信号富集的BRAFi / MEKi耐药性肿瘤亚组中PD-L1也高度上调。总之，这些数据提供了人黑素瘤肿瘤中YAP介导的PD-L1上调的体内证据。

文章编译自：Min Hwan Kim1, Chang Gon Kim1, Sang-Kyum Kim2, Sang Joon Shin, Eun Ah Choe, Su-Hyung Park1, Eui-Cheol Shin1, Joon Kim1.YAP-induced PD-L1 expression drives immune evasion in BRAFi resistant melanoma. Cancer Immunology Research. January 30, 2018.