肝纤维化和肝硬化逆转的组织学评价

郑永见， 汪艳

器官衰竭防治国家重点实验室

广东省肝纤维化工程技术研究中心

南方医科大学肝病研究所

肝纤维化发生是慢性肝组织损伤病理进展的共同通路。了解肝纤维化演变特征，对于预测主要慢性肝病临床病程重要终点，确定及时有效的临床管理方案等都有重要价值。随着慢性肝病治疗学的不断进步，除了判断肝纤维化的分期，评价肝纤维化的变化特征也成为临床治疗决策重要的考虑因素。可量化分析和可反映动态变化已成为对目前纤维化评估技术的重要需求。

近40年来，临床肝纤维化评估方法的研发报道持续不断。简单地从技术角度可以将这些研发技术分为“有创”和“无创”两大类。“有创”是指需要使用肝脏组织的评估方法；而不需要使用肝脏组织的“无创”方法则包括成像工具、血清标志物以及基于人体测量学、分析形态学和（或）人口统计数据的模型等。不同评估方法在可靠性、精确性、操作过程、成本效益、临床验证程度等内在和外在因素方面存在不同特点，因而也就决定了它们有不同的应用特点。本文主要目的是回顾、分析和讨论“有创”的组织学检查在当前慢性肝病管理和临床研究中评价肝纤维化/肝硬化及其逆转的应用价值及研发方向。

1 当前慢性肝病管理有关肝纤维化评价的几个话题

1.1 慢性丙型肝炎（CHC）

长期以来，慢性病毒性肝炎（主要包括HBV和HCV感染）被认为是一类以病毒感染和纤维化相关肝脏并发症为特征的疾病。有不少研究工作比较系统地分析了CHC的肝纤维化自然史。经典的原创性工作，如Poynard等对2235例法国CHC患者肝活组织进行了回顾性横断面研究，发现在疾病进展中的CHC患者，纤维化程度而非炎症水平会随着感染持续时间而递增；随着纤维化的进展，肝细胞癌（HCC）发生的风险也会迅速增加。经抗病毒治疗，相对于非持续病毒学应答患者，持续病毒学应答（SVR）患者更有可能在6个月至5~10年出现肝纤维化/肝硬化消退。目前，使用直接抗病毒药物（DAA）已经可以使90%以上的CHC患者在有限时间内实现病毒学治愈，因此病毒学治愈后的肝病终点事件如何变化成了进一步的重要话题。一项针对933例受试者的前瞻性研究利用FibroTest和FibroScan重复测量10年肝纤维化数据，观测了肝纤维化逆转。该研究发现经病毒学治疗，肝纤维化缓慢消退，肝硬化病例减少5％，原发性肝癌风险仍为5％，表明即使在获得SVR后也不应忽视纤维化相关的肝病问题。作者近期对3243例CHC患者经干扰素治疗获得SVR后的组织学纤维化变化数据进行了Meta分析，发现虽然获得SVR者发生纤维化改善的概率大大增加了，但是约有40%的获得SVR者其纤维化程度在3年内可能改善不明显。而较早前一项研究对HALT-C研究队列的患者数据进行了分析，发现组织学纤维化变化数据与肝脏相关临床结局有显著相关关系。最新基于DAA-SVR的临床数据也提示，基线严重肝纤维化或肝硬化是获得SVR后半年或之后发生HCC的独立危险因素。因此可见，肝纤维化评价仍然是目前CHC患者临床管理的一个重要参考内容。

1.2 慢性乙型肝炎（CHB）

CHB的临床病程由HBV慢性感染和肝脏病变交织而成。感染者从慢性肝炎向肝硬化进展速度的个体差异很大。肝纤维化、肝硬化在CHB相关主要临床不良事件中起关键作用，目前全球HCC病例仍大部分出现在HBV相关肝硬化患者中。此外，肝组织结构的瘢痕变形会严重损害肝细胞功能，导致肝脏失代偿。持续抑制HBV复制能够有效降低肝硬化和HCC发生的风险，改善慢性HBV感染的临床进程，但无法消除肝硬化或HCC。临床研究对如何预测已经发生持续病毒学抑制CHB的严重肝病事件也非常重视。最新发布的基于PAGE-B队列中5年以上有效抗病毒治疗1427例CHB患者的分析数据提示，基线年龄和严重肝纤维化/肝硬化是开始治疗5年以后出现HCC事件的最主要独立危险因素。并且临床指数如PAGE-B评分独立于Ishak评分在预测相关危险度方面似乎有更良好的表现。以上表明，肝纤维化评估对CHB患者临床管理至今仍有重要影响。

1.3 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）

NAFLD正成为全球范围患病率最高的慢性肝病。虽然NAFLD表型相关的病理发生机制具有突出的异质性，但其临床进展表现通常比较缓慢。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）较单纯脂肪肝（NAFL）发展成肝硬化以及HCC等的风险会显著增加。但有些研究也发现，一定比例的NAFL患者也可以进展为有显著纤维化的NASH，并且纤维化进展的发生率可能与NASH患者相当，这表明在伴随着代谢状况恶化的情况下，NAFL也许不完全是良性病程。目前明确诊断NASH仍依赖于肝活组织检查，其组织学特征包括不同程度的肝脂肪变性、小叶间和（或）汇管区周围炎症、肝细胞气球样变，以及纤维化，这些组织学特征有助于提示个体所处的疾病阶段。最新基于来自美国NASH临床研究网络（NASH CRN）两项新药研究PIVENS和FLINT队列的组织学数据表明，NASH、细胞损伤和脂肪变等程度与纤维化变化显著且密切相关，提示这些组织学参数对于临床动态观察都有一定价值。有不少研究发现在所有这些组织学特征描述中，纤维化是预测NAFLD严重预后事件的最强独立因素。NAFLD患者中的纤维化演变速度也存在较大差异，如一组270例早期NAFLD患者进行连续活组织检查，16％的患者可能在4.4年内进展为桥接纤维化。除纤维化指标之外，目前似乎没有其他组织学或非组织学指标能够更可靠地预测NAFLD患者的严重临床事件。

1.4 酒精性肝病（ALD）

酒精相关肝硬化占全球肝硬化死亡的一半，ALD也是全球主要疾病负担之一。ALD可以包括一系列临床和病理学变化包括脂肪肝、酒精性肝炎（AH)、肝硬化及其并发症等。自然史观察研究发现每年大约3% AH患者进展至肝硬化。疾病进展危险因素包括大量饮酒、存在脂肪性肝炎、共患病毒性肝炎、肥胖、吸烟、女性、某些遗传因素等。严重AH（MELD＞20或MDF≥32）或肝硬化并发症常常是ALD初现临床的突出表现，30 d病死率约20%~50%。尽管依据临床病史和生化表现可以进行临床诊断，AH诊断的标准仍是肝活组织检查。这对于指导目前临床治疗如使用糖皮质激素等有重要参考意义。AH的典型组织学表现涉及肝细胞脂肪变和损伤类型与程度、炎性反应细胞种类与分布、纤维化分布与程度、胆汁淤积、胆管反应等各方面。其中，肝纤维化是患者中长期严重预后的独立危险因素之一。如何确认和应用有效的疾病进展标志物是ALD治疗学实践和研发目前面临的主要问题之一。

1.5 其他

除了上述主要几种慢性肝病之外，混合病毒感染或混合病因的肝纤维化病程可能更复杂和更具进展性。由于其他临床指标如病因学、肝功能检查或组织学炎症程度等，可能不足以可靠区分个体患者的预后，因此常常应用纤维化水平来辅助临床决策。类似情况如药物性肝病、遗传性肝病、自身免疫性肝病等诊断也都需要基于各自临床自然史特征的肝纤维化评价方法。

2 组织学评价系统

2.1 半定量评分

迄今为止使用最广泛的评分体系，包括用于评估慢性病毒性肝炎纤维化的Knodell、Ishak、Scheuer/Batts-Ludwig/Tsui和METAVIR系统，以及NASH评分系统，如NASH CRN系统的纤维化评分或欧洲FLIP病理论坛提出的SAF（脂肪变性、炎症活动、纤维化）评分，都采取了半定量评估方式。这些评分系统大多数是在尚缺乏有效治疗的情形下建立的，因此构建这些评分系统的基本思想是基于对病程进展中组织学特征的观察。此外，多年前肝硬化大多被视为无法治愈的终末期肝病，肝硬化动态变化的概念不在评估范围，因此将肝硬化简化为1或2个阶段。这些系统多使用从0~4或0~6等5~7个等级序数来分类从无纤维化到肝硬化的整个过程。使用较多等级序数的系统可以提供纤维化阶段的更多细节，但是与使用较少序数的系统相比，其评分的重复性可能略会降低。

需要指出的是，纤维化分布模式是这些半定量评估系统所对应的描述对象，其预测价值已在临床实践和研究中得以不同程度的验证。病因因素对纤维化分布模式的多样性有明显影响。如慢性病毒性肝炎的特征表现为汇管区周围的改变，纤维化分布模式从汇管区域开始，向肝界板扩张，出现桥接纤维化，最终形成结节性肝硬化；而在成人NASH或AH，典型的纤维化分布初现于中央静脉区周围，即肝腺泡Ⅲ区。值得注意的是，尽管评估系统的种类不断增加，但仍然缺乏涉及混合病因慢性肝病所导致的汇管区和中央静脉区周围变化的评估系统，例如HCV合并NASH或HBV合并AH等。

为了解决对肝硬化进一步评估的问题，还有一些评分系统，如Laennec′s评分系统，Kumar等和Nagula等研究者建立的评估方法等，将肝硬化又细分为2~3阶段。这些评分系统依据了肝硬化的分布特征包括纤维化区域、结节数、结节大小和纤维间隔宽度等。这些分期与临床显著门静脉高压以及肝脏相关事件发生有显著相关关系。

充足的标本大小是影响组织学检查评估准确性的核心问题。不同病因可能对样本大小标准有不同要求。在临床允许的采样尺寸下，活检组织越大，样本的预测性越好。但实际上，与不同评分方法间产生的差异相比，这些差异似乎显得微不足道。除了样本大小问题，简易性、观察者内及观察者间的变异系数、方法的准确性和可重复性也会对诊断结果产生较大影响，尤其是在使用半定量评分系统的情况下。因此针对不同应用情况，需要综合考虑以上因素，来选择最合适的评分系统。同时应当注意，为了避免解读失误，需要专门注释，清楚说明所采用的评分系统。

尽管半定量评分系统目前被作为指导临床实践、试验评估、无创性或其他有创性评估工具研发的参考标准，但这些系统不是理论意义上的完美金标准。该系统在方法学方面的固有缺点是显而易见的，如精度不足（相同分期内的纤维化进展程度会有明显不同，但无法在分期数值上体现这些不同）、缺乏线性（各分期之间并非相等的疾病程度或纤维化程度的间隔）、主观性（读片者对各分期的判断有不同程度的差异）、单向性（分期所指的特征里没有关于纤维化消退的内容）、术语模糊（描述性的专业概念）以及无法普遍适用（需要考虑不同病因等因素选用不同评价方法）等。随着对主要慢性肝病的治疗和机制理解的加速进步，这些局限似乎正在成为治疗学研发过程的技术困难。

2.2 定量胶原面积

胶原纤维是肝纤维化结构的主要成分，通过准确地测量胶原纤维参数能够反映肝纤维化程度。从技术上讲，胶原纤维测量是否准确有两点决定因素，首先目标胶原纤维是否与疾病纤维化有关，其次是应用的测量工具是否可以线性反映选定区域的胶原纤维特征。一般情况下，诊断工具的构建从根本上来说是针对这两点的不同解决方案的组合。胶原纤维面积（CA）作为纤维化测量参数，其与疾病纤维化的相关性在大多数临床研究中已得到验证。在1985年Jimenez等发表的首次相关研究中，组织天狼星红染色被证实可以显示胶原纤维以进行CA测量。随着时间的推移，成像和分析技术不断改进以及多样化，但是CA测量的基本概念几乎保持不变。关于CHC、脂肪性肝炎等慢性肝病患者的量化组织学纤维化评估，至今大多数临床试验仍多采用CA测量。CA测量过程的基本技术策略包括先确定灰度阈值以及之后的识别、检测和计算。此步骤取决于交互式调整，由此可能导致不同研究报告之间的测量数值存在比较大的差异。另有研究指出，尽管CA数值与半定量评分之间存在统计学相关性，但相关性仅限于那些评分较高的数据。这可能归因于取样对纤维化比例变化的影响，或者由于半定量评分系统的早期分期原则与纤维胶原含量并没有太多相关性；另外，图像质量也可能是影响早期阶段纤维胶原评估的因素。到目前为止，CA在临床试验或基础研究中主要用于揭示群体纤维化程度的进展或改善。

2.3 定量胶原分布特征

目前已经认识到纤维化组织的含量和分布特征在不同疾病存在差别，并与临床预后相关。肝脏组织包含了有关纤维化的所有原始和直接信息，因此作者研究组首次提出理论假设—定量肝组织胶原纤维分布特征（CP），也许可以发现更多关于纤维化变化特征的信息。验证该假设的首要步骤是有效和准确地从肝组织中获得纤维化分布特征的信息。实际上，一直以来定量CA研究也不同程度地面对过这个问题，相关研究经验表明，识别胶原纤维的常规组织学技术可能会损害检测分辨的灵敏度。目前多光子、高光谱等显微成像技术被相继开发应用于生物组织纤维化分子识别。这些显微成像技术的共同特点是可以选择性地收集靶分子如胶原蛋白分子、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸分子等的自发荧光发射光谱信号作为其组织成像特征；意味着观察样本无需任何特异性染色，有力提高了图像信息的准确性。通过这些新型技术的高质量上游图像采集，图像分析程序可以在更大程度上避免成像相关人为因素的偏差，将原始图像数据进行有效二进制变换以方便图像分割、定义、识别和分析等处理过程。然而与传统光学显微镜相比，这些相对高级成像技术的应用局限也是显而易见的。其成本相对较高，需要进一步临床验证，并且目前在常规临床实验室的可及程度低。

CP测量与CA测量相比的理论优势在作者系列临床转化研究中已得到初步证实，包括更易于忠实地模拟序数评分，更准确地区分相邻纤维化分期和肝硬化分期，以及减少样本尺寸的变异性等，其临床意义值得进一步观察。

3 肝纤维化/肝硬化改善的组织学评价

组织肝纤维化/肝硬化是纤维化基质过度沉积的结果，具有动态特征，可以发生自发或经过治疗干预后的改善消退。前文分析可知，纤维化是目前已知的主要慢性肝病最重要的预后危险因素之一，因此肝纤维化/肝硬化改善是治疗学研究和实践的主要观察指标。对此，临床治疗学研究目前普遍采用的基本评判方法是，对干预前后肝活检样本使用目前公认的半定量评价系统进行评分，通常将纤维化评分前后没有变化或者降低不少于0或1分值作为慢性肝病治疗有效的重要替代终点和评价依据。

如何更有效地评估肝纤维化/肝硬化逆转，虽然早前有病理学文献详细描述了进展与逆转慢性肝炎纤维化形态学特征与区别，但针对于慢性病毒性肝炎逆转评估的新方法最近才由Sun等首次建立。该研究提出了一套包括进展型、逆转型以及中间型的形态特征定义和分类的系统方法，并将分类系统在71例CHB患者经抗病毒治疗前后的肝活检样本进行了验证。该方法对于评价CHB患者治疗后的组织学改善可能具有重要价值。

肝硬化是慢性肝病管理内容中的重要节点，精准的诊断和评估对改善早期代偿性肝硬化治疗具有重要的临床意义。作者在新近一项研究中基于测量纤维化胶原分布特征的方法学策略，即定量CP策略，初步建立了可以精确描述肝硬化特征组织学组成的新工具，经动物模型和CHB队列初步验证可以实现对肝硬化动态重构的准确描述。此外，作者通过观察CHB EFFORT队列抗病毒治疗前后纵向组织学变化数据发现，基于定量CP策略的测量结果与Ishak纤维化评估对于纤维化逆转率分析结果是一致的。这些初步研究都无疑为分析评估肝纤维化/肝硬化改善提供了新思路，值得进一步验证。

4 总结

肝纤维化相关临床问题一直备受关注，即便是在慢性肝病治疗学正在飞速发展的当下，依然有很多话题有待探索。肝纤维化反复被临床研究证实为慢性肝脏疾病预后的主要独立危险因素。因此我们可以清楚地认识到，解决肝纤维化问题虽然还面临很多任务，但也值得研究者们加倍努力。在组织学评价方面，除前文中提出的问题之外，还有，如其他常见慢性肝病的肝纤维化评价方法与临床意义探寻，如何将组织学检查与无创方法有效配合提高预后分层的有效性和可行性等，也都是研究者们正在不断努力的方向。关于肝纤维化评估，组织学检查显然不是完美标准，在一些临床情况中其应用也正在或者将被日渐成熟的现代无创技术方法所替代，但是随着医学工程学等交叉学科技术不断进步，肝脏组织本身所特有的信息内涵和临床意义会将得到进一步理解和发掘。对于临床实践，其新的辅助意义也值得不断探索。

引证本文：郑永见, 汪艳. 肝纤维化和肝硬化逆转的组织学评价[J]. 临床肝胆病杂志, 2019, 35(4): 709-713.

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本文编辑：王亚南

微信编辑：邢翔宇